JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Биохимических и структурных характеристик углеводный транспорта субстрата белок-SP0092

Published: October 02, 2017
doi:
10.3791/56294
, , ,
1Diamond Light Source,Harwell Science & Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell,Harwell Science & Innovation Campus

Summary

Представлен упрощенный протокол для выполнения обширной биохимических и структурных характеристик связывания белка углеводов субстрат из Streptococcus pneumoniae .

Abstract

Разработка новых противомикробных препаратов и вакцин для пневмококк (пневмококк), необходимо остановить быстрый рост в нескольких устойчивых штаммов. Углеводов субстрата связывания белков (СБП) представляют собой жизнеспособные цели в области развития на основе белков вакцин и новых противомикробных препаратов из-за их внеклеточного локализации и центральной роли импорта углеводов для пневмококковой метаболизма, соответственно. Описанные здесь — это рационализированный Интегрированный протокол провести всеобъемлющую характеристика SP0092, которое может быть распространено на другие углеводы СБП от пневмококка и других бактерий. Эта процедура может помочь проектирования на основе структуры ингибиторов для этого класса белков. Представлены в первой части этой рукописи являются протоколы для биохимического анализа тепловых сдвиг пробирного, мульти угол рассеяния света (MALS) и размер гель-проникающей хроматографии (SEC), которые оптимизировать стабильности и однородности образца направлены на кристаллизации испытания и таким образом повысить вероятность успеха. Второй частью этой процедуры описывает характеристик кристаллов СПР, используя перестраиваемый волны аномальных дифракции Синхротронное излучение и сбор данных протоколы для измерения данных, которые могут использоваться для разрешения кристаллизуется белка структура.

Introduction

S. pneumoniae (пневмококк) является грамположительных бактерий, бессимптомно проживающих в верхних дыхательных путей человека дыхательных путей с возможностью переноса обычно стерильные ниши, вызывая отит, пневмония, сепсис, сепсис, и менингит1,2. Кроме того пневмококковой инфекции является основной причиной внебольничная пневмония, которая вносит вклад в клинической и экономическое бремя во всем мире3,4. Устойчивых к антибиотикам штаммов S. pneumoniae распространились по всему миру и хотя семь валентных и тринадцать Валент пневмококковой белка конъюгатной вакцины помогли снизить уровень устойчивости к противомикробным препаратам, замена штаммов от использование вакцины появились и привели к повышенные требования для проведения исследований в целях разработки новых методов лечения для пневмококковой5,6,,78.

Пневмококк зависит от сахара, импортируемых из принимающих как углерода источник9,10; действительно она посвящает 30% ее импорта техники для перевозки 32 различные углеводы11,,12–13. Эти импортеры включают по меньшей мере восемь ABC-транспортеры13. В ABC транспортеров внеклеточная СБП играют основополагающую роль в определении специфики для лигандов и представления его на интегральный мембранный транспортер для поглощения в ячейке. СБП представляют допустимые цели для разработки новых вакцин и антибиотиков, потому что они поверхностных белков и их жизненно важную роль в клеточных процессах.

Характеристика целевых белков и подробное описание структурных особенностей, как лиганд карманы и укорачивания гибкость, служат полезным средством для наркотиков, на основе структуры дизайн14,15. Рентгеноструктурного анализа является методом выбора для структурной характеристики белков в рядом с атомной резолюции, но процесс кристаллизации является непредсказуемым, много времени и не всегда успешно. Систематические методы улучшили показатель успеха и важными факторами являются образец качества и стабильности. Показатель успеха кристаллизации находится под влиянием химических свойств белков и методологии подготовки образца. Эффект этих могут быть оценены и сообщил биохимических характеристик16,17.

Еще один осложняющий фактор для проектирования на основе структуры является кристаллографических фазы проблемы, которые должны быть рассмотрены. Как больше белковых структур стали доступны, многие структуры может быть решена методом молекулярной замены, который требуется гомологичной структуры18. Как СБП структура гибкой домена, молекулярные замена также может оказаться сложным19. Если не доступен структурная модель, которая достаточно похожа на целевого белка, целый ряд методов может использоваться для получения экспериментальных этапов20. Среди них метод Single волны аномальных дисперсии (ЕАД) стала основной методикой и широко используются для решения проблемы этап21. Использование метода ГРУСТНО было дальнейшее развитие с улучшениями в аппаратного и программного обеспечения, а также стратегий сбора данных для обнаружения и использования слабых аномальных сигналов для постепенного22,23, 24. Кроме того, успехи в прямых методов для решения структур макромолекул, которые в прошлом необходимые данные дифракции атомных резолюции, теперь могут быть использованы, например, объединяя стереохимические знаний как реализовано в программе ARCIMOLDO25. Тейлор26дается полезный обзор методов для решения проблемы фазы в кристаллографии.

Здесь мы представляем рационализированных протокол для характеризации углеводный транспорта СПР, SP0092 S. pneumoniae, интеграции биохимических и структурных методов (рис. 1). Этот шаг за шагом протокол предоставляет полезный пример тестового случая стратегий для улучшения успеха структурных исследований на СБП в целом, которые находятся во всех царств жизни. В частности Протокол подчеркивается важность характеризующих наиболее стабильных олигомерных состояние белка в растворе в быстрый и эффективный метод и позволяет выявить лучших видов следить для кристаллизации экспериментов. Хотя есть более 500 SBP структур, сообщили в банк данных белков27, молекулярные замена может быть сложным из-за присущего гибкий характер двух доменов α/β, которые соединены петли регионе19. Таким образом второй частью протокола описывает использование метода ПЕЧАЛЬНО для постепенного от связанных ионов металлов, который является общим в СБП, а также включение селенометионин и использование селена (Se) ГРУСТНО постепенно.

Protocol

Примечание: кодирующая последовательность, для которой удаляется сигнал пептид клонируется в векторе pOPINF после стандартный протокол-фьюжн; родном протеине выражается как слияние его тег в Escherichia coli BL21 Rosetta клеток 28 , 29. селенометионина, надписью вариант выражается следующие стандартные методы согласно производитель 30. Рекомбинантные SBP очищается, ранее описанные 32 31 ,. 1. биохимическая характеристика Thermal сдвиг Пробирная подготовить 48 буферными растворами с рН от 4.0 9.5 и концентрации NaCl от 0 до 0,5 М и отказаться от 40 мкл в 96-луночных пластины, как описано в Таблица 1 33. Добавить в каждый хорошо 5 мкл раствора СПР на 1-2 мг/мл концентрация. Добавить в каждый хорошо 5 мкл 20 x флуоресцентные пятна для белков (см. Таблицу материалы). Смешать решения, дозирование, печать пластину с помощью прозрачной клейкой пленки и спина на 2 мин на 112 x g при комнатной температуре. Запустите эксперимент на реальном компьютере: установить пандус температура 3 ° C/мин от 4 до 99 ° C с 10 s время и читать флюоресценция каждые 0.5 ° C с возбуждением 483 Нм и выбросов на 568 Нм. Анализ кривых выбросов флуоресценции для каждого буфера состояния, определение температуры плавления (m T) как минимум производная. Примечание: Эта процедура дает хорошее представление о лучших буферного раствора для оказания помощи в повышении стабильности белка. Выберите диапазон pH и концентрации соли, основанный на состояние буфера с высоким T m и добавить 2,5% (v/v) глицерина и 0,5 мм tris(2-carboxyethyl) фосфин (TCEP) для определения буферный раствор для следующих шагов (SEC-буфер). МЭЛС и аналитических SEC выполняют мыть два столбца объем фильтрации столбца предварительно упакованные гель с дегазацию отфильтрованной воды (использование широкого диапазона молекулярный вес 24 мл столбец). Столбец соединиться детектор рассеяние света и сбалансировать столбце с определяется SEC-буфером от тепловой сдвиг пробирного. Придать 100 мкл очищенный СПР на 5 мг/мл в уравновешенной объем один столбец столбец и потока сек сек-буфера. Проверить элюции Хроматограмма для одного или нескольких пиков и изучить с помощью программного обеспечения для анализа, получения Молярная масса и полиизопрена индекс для всех видов данных рассеяния. Примечание: Для каждого пика, соответствующего олигомерных видов, это полезно для проверки полиизопрена индекс рассчитывается как средневзвешенная на массы/Молярная масса, взвешенных по числу молекул (МВт/Mn) Молярная масса. Значение полиизопрена, близкое к 1 указывает пик монодисперсными. Примечание: После определения всех видов олигомеризации это полезно для изучения их зависимость концентрации белка, как более высокие концентрации может пользу более крупные формирования олигомера. Выполнять несколько аналитических SEC запусков; придать 100 мкл очищенный СПР на повышение концентрации (0,1 – 10 мг/мл) в столбце фильтрация уравновешенной гель (использование широкого диапазона молекулярный вес 5 мл столбец) и один столбец объем SEC-буфера потока каждый раз. Проверить элюции Хроматограмма для одного или нескольких пиков и анализировать поглощения света на 280 Нм кривые соответствующие различные начальной концентрации белка. Если относительная интенсивность различных пиков остаются постоянными, Интер преобразования между олигомерных видов не присутствует. Различия в относительной интенсивности в различных концентрациях, является свидетельством взаимное преобразование между разными видами олигомерных, которая зависит от концентрации белка. Примечание: Этот шаг характеристика имеет основополагающее значение для определения, какие виды являются более подходящими для кристаллизации. Действительно, собственный монодисперсными видов более подвержены кристаллизоваться, если они находятся в состоянии постоянного олигомерных в определенной концентрации. 2. Подготовка белка и кристаллизации препаративные SEC после одного столбца объем мыть с дегазацию фильтрованной воды, сбалансировать с SEC-буфера столбце фильтрации препаративной предварительно упакованные гель (широкий молекулярный вес 120 мл колонка). Придать 1-5 мл очищенной СПР в 5-50 мг/мл в уравновешенной гель фильтрации столбцов и потока один столбец объем SEC-буфера. Собирать проточный столбец в 1 мл фракций. Бассейн фракций, соответствующий единый монодисперсных пика; спина образца в 15 мл центрифугирования фильтры на 1500 g и количественного определения концентрации до достижения желаемой концентрации (обычно 50-100 мг/мл для SP0092). Кристаллизации определить оптимальную концентрацию диапазон для кристаллизации эксперимента с использованием предварительной кристаллизации тест как описано изготовителем: дозировки 0,5 – 1,0 мл каждого теста четырех кристаллизации решения в различных водохранилище 24-ну сидел падение пластины кристаллизации. Подготовить кристаллизации капли, смешивая 1 мкл раствора белка с 1 мкл раствора водохранилище, печать пластину и инкубации при комнатной температуре не менее 1 ч (более надежные результаты полученные после ночи инкубации). Проверить падение качества для каждого с помощью микроскопа увеличение 10 x концентрации. Примечание: Тест концентрации по крайней мере три различных белков: (I) большинство капель, оставаясь ясно указывают, что белок является слишком разбавленных для кристаллизации; (II) присутствие тяжелый осадок в большинстве капли подразумевает чрезмерно высокой концентрации; и (III) сбалансированной появление ясно капель и осадок (лучше, если свет) является хорошим свидетельством того, что испытания концентрация является благоприятным для кристаллизации. Подготовить 96-луночных сидя падение пластины кристаллизации; лунки 100 мкл раствора различных коммерческих кристаллизации в каждом резервуаре хорошо 34 , 35 , 36 , 37. отказаться от 100 nL образца протеина на ранее определенной концентрации (шаг 1.1.6) в всех скважинах падение кристаллизации, с использованием роботизированной системы кристаллизации. Отказаться от 100 nL различных водохранилища решения соответствующего кристаллизации падение скважин смешать с белком, обойтись в шаге 2.2.3. Печать пластину кристаллизации, чтобы избежать испарения и включить уравновешивания кристаллизации падение с водохранилище. Проверить капли периодически (первоначально каждые 1-2 дней, затем каждую неделю) (по крайней мере) с помощью 10 x микроскоп увеличением оценки формирования кристалла и роста. Примечание: Автоматизированной системы обработки изображений для кристаллизации белка могут быть использованы для капель визуализации и захватив. 3. Crystal характеристика и сбора данных рентгеновского кристалл монтажа подготовить криопротектора решение путем добавления 25% (v/v) глицерина (конечная концентрация) на состояние кристаллизации (заменив тем самым 25% воды в первоначальном смесь) 38. Заполнить пены Дьюара с жидким азотом и место пример часть корпуса uni-шайба в Дьюара. Позвольте ему остыть до температуры жидкого азота. Вырезать и удалить Уплотнительная лента от пластины кристаллизации над падения, где образуются кристаллы. Место капля 1 мкл раствора криопротектора на coverslide расположены в непосредственной близости от падения целевого. Передачи выбранного кристалл от первоначального падения на падение криопротектора решения с помощью нейлоновых крио цикл на базе стандартных позвоночника, монтируется на 39 , Магнитная палочка 40. Быстро передать кристалла от криопротектора капли жидкого азота, поместив цикл в первый пустой положение держателя образца Уни ПАК. Повторить (от уплотнительной ленты отрезока шаг) до желаемого кристаллы собраны и хранятся в держателя образца Уни ПАК. Место uni шайба основывать на uni шайба с использованием жезла шайбу и принимать шайбу излучение (в условиях жидким азотом). Предупреждение: Чрезвычайно низкой температуры! Использовать крио щипцы и шайба Дьюар инструмент загрузки для загрузки uni-puck(s) излучение Пример смены робота Дьюара. Держателя образца uni шайба будет отсоединить от базового крышкой, оставив петлю держатели образца upright в образце робот Девар и таким образом подвержены жидкого азота и доступной для робота смены образца. Crystal характеристика Примечание: собранный кристаллы могут проверяться затем дифракционного качества, с использованием либо источника рентгеновские лаборатории или рентгеновского источника синхротронного излучения (SR). Излучение макромолекулярной кристаллографии (MX) обеспечивают источник перестраиваемого энергии эксплуатировать аномальных дифракции для структуры решения. В следующем разделе предлагается ряд рабочих инструкций с учетом экспериментальных возможностей MX источник света Diamond излучение, но эти руководящие принципы также может быть адаптирована к MX излучение в других synchrotrons во всем мире. В качестве первого шага, это полезно для подтверждения или выявления аномальных рассеиватели в кристалле. Это может быть удобно достигнуто путем измерения рентгеновский спектр флуоресценции из хрусталя. Сначала установите энергию рентгеновское излучение достаточно высоко, чтобы волновать все элементы обычно ожидается макромолекулярных кристаллов (14 кэВ или выше). Использовать программное обеспечение управления излучение для выберите образец монтируется роботом смены образца; цикл будет автоматически центрируется в рентгеновского луча и центрирование кристалла может быть подтверждено вручную с помощью программного обеспечения управления излучение. Запись рентгеновский спектр флуоресценции с помощью программного обеспечения управления излучение: пользователь выбирает время экспозиции и инициирует измерения (параметр спектр флуоресценции/флуоресценции, → запуска, рис. 2A). Программное обеспечение управления излучение автоматически размещает рентгеновский детектор флуоресценции в место и определяет минимальный инцидент рентгеновского потока получить сигнал чтения на детектор флуоресценции. Приобретенные спектра затем анализируется в автоматическом режиме пиковых выбросов установлены естественным биологических элементов. Эти процедуры доступны в пределах излучение управления программного обеспечения графический интерфейс пользователя (GUI) – GDA (www.opengda.org) в нашей компании и synchrotrons по всей Европе 41 , 42. Если определены подходящие элементы, могут быть использованы для эксперимента аномальных дифракции, выполнить проверку энергии края поглощения рентгеновских для определения оптимальной длины волны для сбора данных аномальных дифракции из хрусталя: на излучение контроль программного обеспечения, выберите элемент и инициировать сканирование (флуоресценции/флюоресценцию параметр сканирования, → атом имя, → запуска, Рисунок 2B). Примечание: Для одного аномального дифракции эксперимента, пик поглощения края используется для максимизации аномальных рассеяния. Экспериментальная соображения для выполнения нескольких волны аномальных дифракции эксперимент были ранее подробные 43. Для определения кристалл блок клеток параметры, симметрия и дифракционный предел, измерить три модели дифракции рентгеновских лучей на 45° с помощью метода колебаний (сбора данных/скрининг → запустить ток, Рисунок 2 c). Программное обеспечение управления излучение предоставляет пользователю с выбором угол колебаний и время экспозиции и возможность установить процент передачи рентгеновского пучка. Для стандартной кристалл скрининга, рекомендуется угол колебаний 0,5 °, выдержка 0,5 сек, и 5% рентгеновского пучка передачи. Измеренных дифракционных изображения автоматически анализируются Эдна трубопровода и возвращать набор стратегий для сбора полного набора данных 22. Рентгеновских сбора данных Примечание: пользователь может выбрать для сбора данных в режиме стандартной колебаний или обратный луч, который позволяет Фриделя товарищей регистрироваться закрыть во времени и дозы рентгеновского и с приблизительно то же поведение поглощения позволяет более точное измерение аномальных различий. Последний является полезным, особенно если ожидаются небольшие аномальных различия и/или образцы являются излучения чувствительных при проведении эксперимента аномальных дифракции. Соображения о лучших стратегий сбора данных для использования были всесторонне рассмотрены 22 , 23 , , 44 45 , 46 , 47. с помощью программного обеспечения управления излучение, импортируйте параметры сбора данных предложенные программы стратегии, которая обеспечит: i. начальное положение оси вращения ω ii. Ширина колебаний ω-оси вращения, угол для каждого изображения дифракции iii. Время экспозиции для каждого изображения дифракции iv. Количество изображений для полного набора данных (косвенно определение угла поворота всего ω-оси для сбора всей данных) v. процент ослабления рентгеновского пучка чтобы избежать чрезмерного воздействия и радиационного повреждения Примечание: В нашем учреждении, для Запуск сбора данных, трубопроводы программного обеспечения для автоматизированной обработки собранных данных хорошо известны: (i) дифракции данных снижаются (индексированные, комплексной и масштабированное) xia2 конвейер, который генерирует файлы МТЗ отражения для пользователя качестве входных данных для структуры и поэтапного решения/уточнение 48. (ii) когда значительный аномальных обнаружения сигнала во время анализа данных, первый быстрый автоматизированных структуры решения трубопровода (fast_ep) с помощью SHELX пытается решить тяжелые атом каркаса, экспериментальный поэтапного, обеспечивая Карта плотности поэтапного электрона где это возможно. Второй более всеобъемлющей структуры решения трубопровода автоматически предпринимает попытки решить и создания структповторно с помощью программного обеспечения независимых апартаментов 49 , 50 , 51 , 52; в тех случаях, когда это успешно пользователь будет предоставляться с начальной плотности карта модель и электронов. Это обеспечивает основу для пользователя, чтобы завершить уточнение и проверить модель с кристаллографических программного апартаментов выбора.

Representative Results

Этот интегрированный протокол доказано, чтобы быть успешным с четырьмя (два опубликованных и два неопубликованных структур) шести углеводов привязки белковых мишеней от пневмококка проанализированы на сегодняшний день32,53. В этом разделе мы представляем биохимических и структурных характеристик SP0092 в результате представителя направлять структурных исследований СБП в целом. После SBP SP0092 выражена и очищенный как определено ранее32, очищенный протеин был проанализирован для буфера стабильности с помощью тепловой сдвиг пробирного: SP0092 экспонатов и увеличение Tm при pH 6,5 и присутствии NaCl в 0 – 0,2 М диапазон концентраций (рис. 3A). В свете этого, буферный раствор для следующих шагов был определен как: 0,02 М MES рН 6,5, 0,2 М NaCl, 2,5% (v/v) глицерина, 0,5 мм TCEP. Абсолютная Молярная масса государств различные олигомеризации SP0092 был измерен MALS, в сочетании с SEC измерения молекулярной массой 187.2, 140,8, 97,0 и 49,4 кДа, соответствует tetrameric, trimeric, димерной и мономерных видов, соответственно () Рисунок 3B). Анализ профиля SEC в разведениях различных белков показал, что олигомеризации вызвано увеличение белка концентрацию, что свидетельствует о более стабильной в более высоких концентрациях, чем обычно используется в крупных олигомеров кристаллизация. Действительно очищенный крупных видов олигомерных направленных процессов кристаллизации, успешно производства белковых кристаллов в то время как мономер видов не. Оптимизированный кристаллы, полученные из родной и Se метионина, помечены форм SP0092 характеризовались дифракции рентгеновских лучей. Измерение рентгенофлуоресцентный от этих кристаллов показали в обоих случаях пики выбросов для Zn, привязанной к белка, в то время как Se был обнаружен только для Se метионина кристаллы, как ожидалось. Позже были проведены рентгеновского поглощения сканирует по краям Se и Zn, который при условии, что прямых экспериментальных данных для настройки инцидента волны рентгеновского до соответствующих краев поглощения рентгеновского Zn или Se присутствует в кристаллы, чтобы максимизировать аномальных сигналов доступный из результирующей данных (рис. 4A–B). После измерения трех дифракционные текстуры на пониженной передачи, аномальных полный набор данных был получен с помощью стратегии сбора данных, предложенный Эдна (рис. 4 c). Аномальных сигналов настоящий триггеры автоматизированных этапов конвейера на излучение определить вложенные структуры, и на основе первоначальных экспериментальных этапов производные, производит первоначальные карты и моделей, которые затем можно уточнить и проверяются (Рисунок 4 d ). Таким образом потенциальные ловушки техники сосредоточены главным образом на кристалл доступности и качества. Оптимизация условий буфера для улучшения устойчивости белка, а также определение наиболее подходящего олигомерных состояния белка для использования, когда более чем один олигомера определяется в решении, может уменьшить риск неудачи при кристаллизации стадии. Эксплуатации использование связанных ионов металлов, выявленных на ранней стадии может ускорить структуры решения и избежать ненужного производства селенометионина, надписью белка, когда методы молекулярной замена не. Рисунок 1. Диаграмма рабочего процесса для биохимических и структурных характеристик углеводов СБП. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2. Crystal характеристика в GDA. (A) скриншот вкладки управления рентгеновской флуоресценции GDA излучение управляющего программного обеспечения. (B) скриншот рентген энергетического края-управления закладка в GDA. (C) скриншот вкладки скрининг кристалл сбора данных в GDA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. На рисунке 3. Биохимическая характеристика SP009239-491. (A) 3D-поверхности граф заговоре температуру плавления SP009239-491 как функция pH и концентрации NaCl буферного раствора. (B) SEC и MALS результаты для SP009239-491. Поглощение в 280 Нм показаны синим цветом. Молярной массы государств различные олигомеризации показаны красным цветом. Панель (B) был изменен с32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4. Структурные характеристики SP009239-491. (A) и (B) рентгеновского поглощения энергии сканирования на краю Zn, Se SP009239-491 кристаллов. Измерений флуоресценции от Zn, Se, содержащие кристаллы показано в синий и бирюзовый, рассчитанные f’ и f «аномальных рассеяния фракций находятся в зеленый и красный, соответственно. (C) примеры шаблонов рентгеновской дифракции собранные от SP009239-491 кристаллов. (D) мультфильм представление структуры димера SP009239-491 . Один protomer – цвета белый и другие пурпурный (остатки 39-366) и фиолетовый (остатки 367-491), и аномальных рассеяния атомы представлены как синий и голубой шарики для Zn, Se, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 0,1 лимонная кислота М рН 4,0 0,1 лимонная кислота М рН 4.5 0,1 М фосфат рН 5,0 0,1 М цитрат рН 5,5 0,1 бис трис рН М 6 0,1 М ADA рН 6,5 0,1 М MOPS рН 7 0,1 М HEPES pH 7.5 0,1 М имидазола рН 8,0 0,1 М трис рН 8,5 0,1 М CHES рН 9 0,1 М CHES рН 9,5 NaCl 0 M 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ NaCl 0,1 М 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ NaCl 0,2 М 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ NaCl 0.5 M 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ 40 МКЛ Таблица 1. Композиция буфера для assay тепловой сдвига.

Discussion

В этой статье мы описать и проверить Интегрированный протокол для биохимических и структурных характеристик углеводов СБП с уделением особого внимания белки от S. pneumoniae. Тем не менее это может использоваться как стандартная процедура для анализа других СБП из разных организмов и даже другие несвязанных растворимые белки.

Первая часть протокола ориентирована на предоставление биохимических информации о стабильности белка и четвертичной структуры, которая может быть использована в подготовке образцы протеина для кристаллизации. В разделе анализов тепловой сдвиг мы опишем только pH и вариации концентрации NaCl сохранить общий характер этой процедуры. Несмотря на это, многие другие условия буфер может быть проверена в Аналогичным образом, например, включая любое химическое соединение используется в качестве стабилизирующей добавки: в частности фактической ligand(s), привязанные к конкретным SBP чрезвычайно эффективной в повышении Тм на несколько градусов Цельсия31. В некоторых случаях денатурируя кривые могут быть плохо определены связи сигнал низкого или высокого флуоресценции фон, который вызвано агрегации белков или частичной разворачивается. Чтобы избежать этого, белок: краска титрование может выполняться для оптимизации неясным денатурируя кривых. Если улучшения не получается, рекомендуется Скрининг различных добавок, которые могут улучшить стабильность белка, и подходящие экраны были ранее описанных54.

Как правило большинство СБП мономерных в их естественной среде, но как здесь показано, что multimerization может произойти в более высоких концентрациях, используемых в экспериментах кристаллизации, таким образом характеристика поведения олигомеризации, предоставляемый МЭЛС и SEC важное значение для оценки наиболее благоприятный стабильной монодисперсных олигомеризации состояния для кристаллизации. Тем не менее трудно предсказать влияние различных химических веществ, включенных в состоянии кристаллизации на поведение олигомеризации протеинов. Если экспертиза SEC и MALS показывает обширные агрегации белков образца, мы рекомендуем следующие действия, чтобы уменьшить вероятность возникновения такой ситуации: использовать образец свежие протеина (не замораживания размораживания) и раскройте стабилизации анализа с тепловой сдвиг анализов, тестирование можно добавки и мягкими моющими средствами как последний ресурс, чтобы свести к минимуму агрегации. В этой статье мы представляем основные руководящие принципы для кристаллизации, с помощью скрининга коммерческих кристаллизации высок объём разреженных матриц для поддержания общего характера настоящего Протокола. Однако, получение кристаллов протеина высокого разрешения рентгеновской дифракции может потребоваться итеративный тонкой настройки для оптимизации условий кристаллизации в отношении осадителя концентрации, pH, добавления химических добавок, различных температурах, и другие факторы меняющейся динамики равновесия между кристалл падение и водохранилище16,17.

Второй частью протокола описывает характеризации кристаллов белков для определения оптимальной стратегии сбора данных рентгеновской дифракции с особым упором на приобретение аномальных данных для постепенного ГРУСТНО. Даже если СБП поддерживать аналогичные общая архитектура (и есть много хранение 3D структуры, потенциально может использоваться как начиная модели), поэтапного осуществления этих белков методом молекулярной замена не всегда просто из-за изменчивости элементы вторичной структуры и внутренняя гибкость этих белков. Следовательно, мы предлагаем метод ГРУСТНО и подчеркнуть, что эти белки могут уже неразрывно связаны металлов или действительно неспецифической привязки металлов от кристаллизации буфера условий, которые могут обеспечить целый ряд аномальных Дифрагирующая элементов как Стандартный шаг в наш общий протокол.

В заключение этот протокол определяет стандартный рабочий процесс гидом процедур, позволяя подробное описание биохимических и структурных особенностей СБП, которые могут быть использованы для увеличения успеха определение структуры, а также ускорить структурные характеристики СБП в целом.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы признаем ОНПФ-UK для помощи в клонирования, Джемма Харрис SEC-центры и ученые излучение I03 и I04 на источник света алмазов.

Materials

SelenoMethionine Medium Complete Molecular Dimensions MD12-500 Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies.
MicroAmp Optical 96-Well plate Applied Biosystems 4306737 The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems® 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
SYPRO Orange Molecular Probes S6651 SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions.
MicroAmp Optical Adhesive film Applied Biosystems 4311971 The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background.
7500 Fast Real-time PCR System Applied Biosystems 4362143 The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software.
Superdex 200 increase 10/300 GL column GE Healthcare 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques.
DAWN HELEOS II Wyatt DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided.
Superdex 200 5/150 GL GE Healthcare 28906561 Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the "increase" version but this model is ideal for the standard day by day use.
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335 HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography.
24 Well "Big" Sitting Drop Crystallization Plate MiTeGen XQ-P-24S-A The 24 well "big" crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips.
PCT Pre-Crystallization Test Hampton HR2-140 The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening.
96 Well CrystalQuick Greiner bio-one 6098xx Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult.
Uni-Puck Molecular Dimensions MD7-601 The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide – includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA)
Standard Foam Dewar Molecular Dimensions MD7-35 5.7" diameter by 2.8" deep. 800mL capacity.
Mounted CryoLoop – 20 micron Hampton HR4-955 Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes™ that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools.
CryoWand Molecular Dimensions MD7-411
Puck dewar loading tool Molecular Dimensions MD7-607 This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Austrian, R. Prevention of pneumococcal infection by immunization with capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae: current status of polyvalent vaccines. J Infect Dis. 136, S38-S42 (1977).
  2. Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect Dis. 4 (3), 144-154 (2004).
  3. van Mens, S. P., et al. Longitudinal analysis of pneumococcal antibodies during community-acquired pneumonia reveals a much higher involvement of Streptococcus pneumoniae than estimated by conventional methods alone. Clin Vaccine Immunol. 18 (5), 796-801 (2011).
  4. Weycker, D., Strutton, D., Edelsberg, J., Sato, R., Jackson, L. A. Clinical and economic burden of pneumococcal disease in older US adults. Vaccine. 28 (31), 4955-4960 (2010).
  5. Doern, G. V. Antimicrobial use and the emergence of antimicrobial resistance with Streptococcus pneumoniae in the United States. Clin Infect Dis. 33, S187-S192 (2001).
  6. Vasoo, S., et al. Increasing antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae colonizing children attending day-care centres in Singapore. Respirology. 16 (8), 1241-1248 (2011).
  7. Black, S., et al. Efficacy, safety and immunogenicity of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Northern California Kaiser Permanente Vaccine Study Center Group. Pediatr Infect Dis J. 19 (3), 187-195 (2000).
  8. Hanage, W. P., et al. Diversity and antibiotic resistance among nonvaccine serotypes of Streptococcus pneumoniae carriage isolates in the post-heptavalent conjugate vaccine era. J Infect Dis. 195 (3), 347-352 (2007).
  9. Burnaugh, A. M., Frantz, L. J., King, S. J. Growth of Streptococcus pneumoniae on human glycoconjugates is dependent upon the sequential activity of bacterial exoglycosidases. J Bacteriol. 190 (1), 221-230 (2008).
  10. King, S. J. Pneumococcal modification of host sugars: a major contributor to colonization of the human airway?. Mol Oral Microbiol. 25 (1), 15-24 (2010).
  11. Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293 (5529), 498-506 (2001).
  12. Buckwalter, C. M. Pneumococcal carbohydrate transport: food for thought. Trends Microbiol. 20 (11), 517-522 (2012).
  13. Bidossi, A., et al. A functional genomics approach to establish the complement of carbohydrate transporters in Streptococcus pneumoniae. PLoS One. 7 (3), e33320 (2012).
  14. Zheng, X., Gan, L., Wang, E., Wang, J. Pocket-based drug design: exploring pocket space. AAPS J. 15 (1), 228-241 (2013).
  15. Singh, S., Malik, B. K., Sharma, D. K. Molecular drug targets and structure based drug design: A holistic approach. Bioinformation. 1 (8), 314-320 (2006).
  16. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein crystallization for X-ray crystallography. J Vis Exp. (47), (2011).
  17. Bergfors, T. . Protein crystallization: techniques, strategies, and tips. A laboratory manual. , (1999).
  18. Scapin, G. Molecular replacement then and now. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 11), 2266-2275 (2013).
  19. Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The “Venus’s-flytrap” model. J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).
  20. McCoy, A. J., Read, R. J. Experimental phasing: best practice and pitfalls. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 458-469 (2010).
  21. Dodson, E. Is it jolly SAD?. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1958-1965 (2003).
  22. Incardona, M. F., et al. EDNA: a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. J Synchrotron Radiat. 16 (Pt 6), 872-879 (2009).
  23. Popov, A. N., Bourenkov, G. P. Choice of data-collection parameters based on statistic modelling. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 7), 1145-1153 (2003).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Can I solve my structure by SAD phasing? Planning an experiment, scaling data and evaluating the useful anomalous correlation and anomalous signal. Acta Crystallogr D Struct Biol. 72 (Pt 3), 359-374 (2016).
  25. Millan, C., Sammito, M., Uson, I. Macromolecular ab initio phasing enforcing secondary and tertiary structure. IUCrJ. 2 (Pt 1), 95-105 (2015).
  26. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 325-338 (2010).
  27. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 235-242 (2000).
  28. Bird, L. E., et al. Green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. J Vis Exp. (95), e52357 (2015).
  29. Berrow, N. S., et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res. 35 (6), e45 (2007).
  30. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  31. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. , (2016).
  32. Culurgioni, S., Tang, M., Walsh, M. A. Structural characterization of the Streptococcus pneumoniae carbohydrate substrate-binding protein SP0092. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 73 (Pt 1), 54-61 (2017).
  33. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357 (2), 289-298 (2006).
  34. Wooh, J. W., Kidd, R. D., Martin, J. L., Kobe, B. Comparison of three commercial sparse-matrix crystallization screens. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 4), 769-772 (2003).
  35. Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov Today. 21 (5), 819-825 (2016).
  36. Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221 (1), 31-34 (1991).
  37. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 10), 1426-1431 (2005).
  38. Garman, E. F., Mitchell, E. P. Glycerol concentrations required for cryoprotection of 50 typical protein crystallization solutions. Journal of Applied Crystallography. 29 (5), 584-587 (1996).
  39. Teng, T. -. Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  40. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 10), 1251-1259 (2006).
  41. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. J Synchrotron Radiat. 17 (5), 700-707 (2010).
  42. Leonard, G. A., et al. Online collection and analysis of X-ray fluorescence spectra on the macromolecular crystallography beamlines of the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 333-335 (2009).
  43. Walsh, M. A., Evans, G., Sanishvili, R., Dementieva, I., Joachimiak, A. MAD data collection – current trends. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1726-1732 (1999).
  44. Dauter, Z. Data-collection strategies. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1703-1717 (1999).
  45. Finke, A. D., et al. Advanced Crystallographic Data Collection Protocols for Experimental Phasing. Methods Mol Biol. 1320, 175-191 (2016).
  46. Gonzalez, A. Optimizing data collection for structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1935-1942 (2003).
  47. Leslie, A. G. The integration of macromolecular diffraction data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 1), 48-57 (2006).
  48. Winter, G., Lobley, C. M., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 7), 1260-1273 (2013).
  49. Sheldrick, G. M. Experimental phasing with SHELXC/D/E: combining chain tracing with density modification. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 479-485 (2010).
  50. Skubak, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nat Commun. 4, 2777 (2013).
  51. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (Pt 6), 582-601 (2009).
  52. Vonrhein, C., Blanc, E., Roversi, P., Bricogne, G. Automated structure solution with autoSHARP. Methods Mol Biol. 364, 215-230 (2007).
  53. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. 25 (1), 79-93 (2017).
  54. Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).

Tags

Carbohydrate TransportSubstrate-binding ProteinStreptococcus PneumoniaeBiochemical CharacterizationStructural CharacterizationBuffer StabilityOligomerizationCrystallizationSize-exclusion ChromatographyMulti-angle Light ScatteringPre-crystallization TestingProtein ConcentrationCrystallization Screening

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Culurgioni, S., Tang, M., Hall, D. R., Walsh, M. A. Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092. J. Vis. Exp. (128), e56294, doi:10.3791/56294 (2017).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image