Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

In Vivo DNA schade signalering is niet goed begrepen
In vivo, is DNA complexvorm met histonen en andere factoren aan formulier chromatine vezels. Regulering van de structuur van de chromatine is van het allergrootste belang voor DNA-metabolisme. Bijvoorbeeld, is de Histon variant H2AX phosphorylated door Ataxie Teleangiëctasie gemuteerd (ATM) en andere kinases volgende dubbel-strand (DSB) inductie breekt, en is belangrijk voor DSB schade signaal versterking, alsmede het verstrekken van een docking site voor andere factoren. Verspreiding van schade signalering en reparatie traject keuze lijken te kritisch worden beïnvloed door lokale chromatine structuur bij schade sites¹. Een aantal chromatine remodeling factoren, histone chaperones en Histon wijzigen enzymen inderdaad schade sites worden gerekruteerd en zijn belangrijk voor efficiënte DNA-reparatie, benadrukken het belang van chromatine verordening in de DDR en² reparatie ^{, 3 , 4}. bovendien schade site clustering of herpositioneren werd waargenomen in gist en drosophila^5,6,7,8, die doet denken aan Herlokalisatie van gene loci in de subnuclear compartiment gene verordening^9,10is gekoppeld. Recente studies in muizen en menselijke cellen bleek ook mobilisatie van DSB sites, welke invloeden trouw en traject keuze^{11,12 repareren}. Dit leidt tot de mogelijkheid dat DDR/reparatie ook worden nauw met nucleaire architectuur, organisatie van de chromatine van hogere-orde en chromosoom dynamiek in de celkern verbonden kan. Het is dus een kritische studie van de DDR en herstelprocessen in het kader van de endogene nucleaire omgeving in een levende cel om te begrijpen van de korte – en lange termijn gevolgen van DNA-beschadiging high-resolution methoden te ontwikkelen.

Kritische rol van PAR Polymerase (PARP) in het meten van de omvang en de soort schade en het regelen van eiwit vergadering op de Site van de schade
PARP1 is een DNA nick sensor snel geactiveerd door DNA-schade die een cruciale rol in DNA reparatie^{13 speelt}. PARP1 was oorspronkelijk gedacht te functioneren samen met X-Ray repareren Cross aanvulling 1 (XRCC1) ter vergemakkelijking van de base excision repair (BER), maar recente studies onthullen haar rol in andere DNA repair pathways, met inbegrip van DSB reparatie¹⁴. PARP1 gebruik nicotinamide adenine dinucleotide (NAD⁺) geactiveerd als substraat om ADP-ribosylate meerdere doel eiwitten, met inbegrip van zelf. Dit enzym en andere familieleden hebben aangetrokken veel aandacht in de afgelopen jaren als PARP-remmers als veelbelovende therapeutische geneesmiddelen voor kanker opgedoken. Hoewel de PARP-remmers bleken aanvankelijk te worden effectief in het borstkankergen (BRCA)-gemuteerd borstkankercellen, er is nu een overvloed aan bewijs voor de gevolgen daarvan in mono- en combinatie therapieën samen met DNA beschadigen agenten/bestraling tegen een breed spectrum van kanker met mutaties niet beperkt tot BRCA^{15,16,17,18,19,20}.

Op moleculair niveau, werd PARP activering getoond om te spelen belangrijke rol bij het organiseren van de structuur van de lokale chromatine op schade sites. PAR-afhankelijke aanwerving van chromatin wijziging enzymen vergemakkelijkt DSB reparatie en dicteert herstel traject keuzes, suggereren de belangrijke steigers rol van PAR wijziging op schade sites. ¹³,^{21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31} we onlangs aangetoond de uitsluiting van p53-bindend-proteïne 1 (53BP1) tegen schade door PAR ³², bieden een alternatieve verklaring voor 53BP1-afhankelijke hyperactivering van niet-homologe endjoining (sites NHEJ) door de PARP-remmer en het benadrukken van het belang van PARP in DSB repareren traject keuze^33,34. PARP1 ook factoren rechtstreeks PARylates en is van invloed op de activiteit van meerdere DNA repair¹⁴.

Met behulp van Laser Microirradiation als een instrument om te studeren DDR/reparatie In Vivo
Laser microirradiation tot sub micron wijzigingen op afzonderlijke chromosomen werd eerst beschreven in 1969³⁵ en herzien in detail in 1981³⁶. Enkele decennia later, laser microirradiation bleek voor het opwekken van DNA-beschadiging op een gedefinieerde submicrometer regio in de celkern, en bleek te zijn een waardevolle techniek te studeren aanwervings- en wijzigingen van verschillende factoren aan DNA laesies in vivo ^{13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41}. deze methode maakt de ontdekking van de factoren die geen aparte bestraling-geïnduceerde foci (IRIF vormen) bij schade sites^39,42. Het is ook mogelijk om te onderzoeken de spatio dynamiek van chromatine structurele wijzigingen zowel op schade plaatsen en in de rest van de kern. Wij zorgvuldig ten opzichte van de DDRs die zijn geïnduceerd door verschillende laser-systemen en de inbreng van de bevoegdheden om te evalueren van de relatie tussen het type van DNA-schade en de microirradiation voorwaarden^{32,43,44, 45}. De afwijkende werving patronen van 53BP1 en Telomere Herhaal bindende factor 2 (TRF2) werden waargenomen in de vorige laser schade studies, die vormde de basis voor de terugkerende zorg voor de “niet-fysiologische” aard van de laser-veroorzaakte schade^{46 ,47,48,49}. We vonden dat deze duidelijk verschillen nu kon worden verklaard door differentiële PARP signalering die meters de hoeveelheid en complexiteit van geïnduceerde schade³². We bevestigd dat: 1) laser-microirradiated cellen (zelfs na hoge input-power bestraling) in interfase in een schade checkpoint controle-afhankelijke manier worden gearresteerd en levensvatbaar blijven (minstens tot 48 h)^32,50; en 2) reparatie factor werving/wijzigingen getrouw recapituleren die waargenomen met de behandeling met conventionele DNA schadelijke stoffen en DSB inductie door enzym^{32,39,42, 44},^,50,51,52. Deze resultaten is groot voorstander van de fysiologische relevantie van het bestuderen van laser schade-geïnduceerde cellulaire reacties.