JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genética

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

Published: January 31, 2018
doi:
10.3791/56213
, , , , , ,
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine,University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic,University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences,University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery,University of California, Irvine

Summary

Bu protokol lazer microirradiation DNA hasar, nispeten basit kırılmalara ve DNA hasar sinyal ve onarım faktör montaj hasar sitelerde içinde vivo çalışmaya karmaşık hasarı gibi farklı türde ikna etmek için nasıl kullanılacağını açıklamak için hedeftir .

Abstract

DNA hasarı genom bütünlüğünün korunması için önemlidir hücredeki belirli sinyal ve onarım yanıt neden olmaktadır. Lazer microirradiation DNA hasarı yanıt (DDR) vivoaraştırmak için değerli bir deneysel araç oldu. Hücre çekirdeği submicrometer bölgede sınırlı lazer kaynaklı hasara cevaben makromoleküllerin dynamics gerçek zamanlı yüksek çözünürlüklü tek hücreli analiz sağlar. Ancak, çeşitli lazer koşullar indüklenen zarar türleri farklılıkları takdir olmadan kullanılmaktadır. Sonuç olarak, çoğu zaman hasar doğası değildir belirgin tutarsızlıkları işe alım veya değişiklik profillerindeki neden karakterize veya kontrollü, iyi. Biz farklı ışınlama koşulları (örneğin, farklı dalga boylarında gibi farklı giriş (irradiances) güçlerin femtosecond (fs) yakın kızılötesi (Nur) lazer) farklı DDR ve onarım protein derlemeler indüklenen gösterdi. Bu üretilen DNA hasar türünü yansıtır. Bu protokolü nasıl farklı tutarlarda indüksiyon ve kolayca Bankası ve crosslinking zararlar, fark Poli (ADP-riboz) (PAR) sinyal, algılama tarafından takip edilebilir DNA hasarı karmaşıklığı titrasyon lazer giriş güç sağlar açıklar ve yol özgü onarım faktör derlemeler hasar sitelerde. Bir kez hasar koşulları belirlenir, farklı zarar karmaşıklık ve diferansiyel hasar sinyal etkileri yanı sıra ilgi herhangi bir faktör üzerinde ters yönde factor(s) tükenmesi araştırmak mümkündür.

Introduction

Vivo DNA hasarı sinyal de anlaşılmadı mı
Vivo, DNA Histon ve diğer faktörler formu Kromatin iplikler için complexed olduğunu. Düzenleme Kromatin yapısı, DNA metabolizması için büyük önem taşımaktadır. Örneğin, Histon değişken H2AX mutasyona uğramış ataksi-Telanjiektazi (ATM) ve aşağıdaki iki iplikçikli (DSB) indüksiyon tatili ve yerleştirme bir site için diğer sağlamak olarak DSB hasar sinyal güçlendirme için önemli diğer kinazlar tarafından fosforile etkenler. Hasar sinyal ve onarım yolu seçimi yayılan görünür eleştirel yerel Kromatin yapısı hasar siteleri1tarafından etkilendiği için. Faktörler, Histon chaperones ve enzimler değiştirme Histon remodeling Kromatin birkaç siteleri zarar için gerçekten işe ve DDR yönetmelikte Kromatin önemini vurgulayarak verimli DNA tamiri için önemlidir ve2 onarım , 3 , 4. Ayrıca, kümeleme veya yeniden konumlandırma hasar sitesi Maya ve drosophila5,6,7,8, gen loci relocalization anımsatan gözlenmiştir gerçekliğimizin bölme gen Yönetmeliği9,10ile ilişkili. Fare ve insan hücreleri son araştırmaları Ayrıca seferberlik hangi etkileri sadakat ve yol seçim11,12onarmak DSB sitelerin saptandı. Bu DDR/onarım da yakından nükleer mimarisi, üst düzey Kromatin organizasyon ve kromozom ile hücre çekirdeği dinamiklerini bağlantılı olabilir ki olasılığını yükseltir. Böylece, DDR çalışma ve onarma işlemlerinde canlı hücrede endojen nükleer çevre bağlamında kısa ve uzun vadeli sonuçları DNA hasarı anlamak için yüksek çözünürlüklü yöntemleri geliştirmek için önemlidir.

Ölçüde ve hasar türünü ölçme ve Protein derleme hasar sitesinde düzenleyen PAR polimeraz (PARP) kritik rolü
PARP1 hızla DNA onarım13‘ te kritik bir rol oynamaktadır DNA hasarının aktif bir DNA nick sensör olduğunu. PARP1 x-ışını onarmak çapraz tamamlayan baz eksizyon tamir (BER) kolaylaştırmak için 1 ile birlikte (XRCC1) çalışması için Aslında düşündüm fakat DSB onarım14dahil olmak üzere diğer DNA onarım yolları rolü son yıllarda yapılan çalışmalarda ortaya koyuyor. PARP1 kullandığı Nikotinamid adenin dinükleotit (NAD+) ADP-ribosylate için bir substrat olarak kendisi de dahil olmak üzere birden çok hedef proteinler aktif. PARP inhibitörleri olarak umut verici tedavi ilaçlar kanser için ortaya çıktı gibi bu enzim ve diğer aile üyeleri son yıllarda çok dikkat çekmiştir. PARP inhibitörleri başlangıçta meme kanser geni (BRCA1) etkili olduğu bulundu rağmen-mutasyona meme kanseri hücreleri, şimdi kanıt etkileri ajanlar/ışınlama karşı zarar DNA ile birlikte mono – ve kombinasyonu tedaviler için bir bolluk olduğunu Kanser için BRCA115,16,17,18,19,20sınırlı değildir mutasyonlar ile geniş bir yelpazede.

Moleküler seviyede PARP etkinleştirme yerel Kromatin yapısı hasar sitelerdeki organize kritik rol oynamak için gösterildi. Kromatin modifikasyon enzimleri alımı PAR-bağımlı DSB onarım kolaylaştırır ve baskıları yolu seçimler, PAR değişiklik hasar sitelerdeki önemli iskele rolü düşündüren onarmak. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 biz son zamanlarda gösterdi p53-bağlayıcı protein 1 (53BP1) dışlanması zararlardan siteleri homolog olmayan endjoining () 53BP1 bağlı hyperactivation için alternatif bir açıklama sağlayan PAR 32tarafından NHEJ) tarafından PARP onarım inhibitörü ve DSB PARP önemini vurgulayarak yolu seçim33,34. Onarım faaliyetin birden fazla DNA’ın PARylates ve etkileri doğrudan PARP1 de14faktörler.

Lazer Microirradiation DDR/onarım Vivo içinde çalışmak için bir araç olarak kullanarak
Alt mikron değişiklikler üzerinde bireysel kromozomlar üretmek için lazer microirradiation ilk 196935 içinde açıklanan ve ayrıntılı olarak 198136gözden. Birkaç yıl sonra lazer microirradiation, hücre çekirdeği tanımlanmış submicrometer bölgede, DNA hasar ikna etmek için gösterildi ve işe alım veya DNA lezyonlar içinde vivo çeşitli faktörlerin değişiklikleri incelemek için değerli bir teknik olduğu kanıtlanmıştır 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. bu yöntem farklı ışınlama kaynaklı foci (IRIF) oluşturmaz bu faktörlerin tespiti hasar siteleri39,42, sağlar. Kromatin yapısal değişiklikler hasar siteleri hem çekirdeği geri kalanında kronolojik zamanmekansal dinamiklerini incelemek mümkündür. Biz dikkatle farklı lazer sistemleri tarafından indüklenen DDR’lar göre ve giriş yetkileri DNA hasar türünü ve microirradiation koşulları32,43,44, arasındaki ilişki değerlendirmek için 45. Anormal işe alım kalıpları 53BP1 ve telomeric bağlayıcı faktör 2 (TRF2) lazer kaynaklı hasar46 “fizyolojik olmayan” doğası için yinelenen endişe için temel sağlanan önceki lazer hasar çalışmaları, gözlendi tekrar ,47,48,49. Bu belirgin farklılıklar şimdi fark PARP tarafından açıklanabilir hangi indüklenen zarar32karmaşıklığını ve miktarını ölçer sinyal bulduk. Biz doğruladı: 1) lazer-microirradiated hücreleri (yüksek giriş güç ışınlama) sonra bile Interphase içinde bir hasar denetim noktası denetim bağlı şekilde tutuklandı ve geçerli kalır (en az en fazla 48 saat)32,50; ve 2) onarım faktör işe alım/değişiklikler sadakatle bu geleneksel DNA zararlı ajanlar ile tedavi ve DSB indüksiyon ile endonucleases32,39,42tarafından, gözlenen özetlemek 44,50,51,52. Bu sonuçlar güçlü lazer zarar indüklenen hücresel yanıt eğitimi fizyolojik alaka destek.

Protocol

1. temel hücre hazırlık Not: Bu standart ayirt endojen protein alımı veya değişiklik algılanması ve stabil bir fluorescently tagged rekombinant protein ifade bir hücre kültürünü kullanımı için bir adımdır. Örneğin, Potorustridactylus (PtK2) keseli böbrek epitel hücreleri stabil EGFP-53BP11220-1711 veya TRF2-YFP ifade bizim önceki kullanılmıştır (şekil 1)32çalışma. Eski durumda, 53BP1 bölges…

Representative Results

Stabil EGFP-53BP11220-1711 veya TRF2-YFP ifade PtK2 hücreleri kullanarak, lazer giriş gücü titrasyon onların işe alım (şekil 1)32için en uygun koşul belirlemek için gerçekleştirilmiştir. Yüksek giriş güç lazer hasar siteler, önemli CPD (genellikle ultraviyole (UV) hasar tarafından oluşturulan crosslinking hasar), özellikle baz hasarı tanır GFP-NTH1 DNA glycosylase yanı sıra kümeleme gözlendi. Buna ek o…

Discussion

Lazer microirradiation DDR araştırma için kullanmanın yararları şunlardır:

1. bu farklı teşvik için uygun ve DNA’ın tutarları basit kırılmalara karmaşık DNA hasar zarar ve algılamak için farklı onarım faktörler DNA, siteleri lazer ışınlama parametreleri ayarlayarak zarar. Hasar birden çok kez aynı hücre çekirdeği içinde trans etkileri ( şekil 3) olduğu gibi değerlendirmek için mümkündür.

2. …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz Dr Akira Yasui Tohoku Üniversitesi, Japonya için GFP-NTH1 ifade Plazmid ve Dr Eros Lazzerini Denchi Scripps Araştırma Enstitüsü, La Jolla, Kaliforniya TRF2-YFP ve EGFP-53BP11220-1711 ifade plazmid için teşekkür ederiz. Bu eser Hava Kuvvetleri Office bilimsel araştırma (FA9550-04-1-0101) ve Beckman lazer Enstitüsü A.ş. Vakfı (için M.W.B), Ford Vakfı Bursu ve NSF MCB-1615701 ve CRCC Bilimleri (için B.A.S), ulusal Akademisi tarafından desteklenmiştir CRR-17-426665 (için K. Y.).

Materials

Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread–chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R., Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed?. Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A., Piccart, M. An update on PARP inhibitors–moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27 (2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O’Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68 (2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548 (2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219 (2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460 (2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

Tags

Laser MicroirradiationDNA DamageDNA RepairDNA Repair FactorsCellular ResponseReal-time AnalysisSingle-cell AnalysisFluorescently-tagged Proteins53BP1NTH1Liposome-mediated Transfection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Kong, X., Cruz, G. M., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image