Summary

Ein modifiziertes Hefe-ein-Hybrid-System für Heteromere Protein-Komplex-DNA-Interaktionsstudien

Published: July 24, 2017
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Summary

Der hier beschriebene modifizierte Hefe-Ein-Hybrid-Assay ist eine Erweiterung des klassischen Hefe-Ein-Hybrid- (Y1H) -Assays, um die heteromere Protein-Komplex-DNA-Wechselwirkung in einem heterologen System für jede funktionelle Genomforschung zu untersuchen und zu validieren.

Abstract

Im Laufe der Jahre hat sich der Hefe-Ein-Hybrid-Assay als eine wichtige Technik zur Identifizierung und Validierung von physikalischen Wechselwirkungen zwischen Proteinen wie Transkriptionsfaktoren (TFs) und deren DNA-Ziel erwiesen. Die hier vorgestellte Methode nutzt das zugrunde liegende Konzept des Y1H, wird aber modifiziert, um Protein-Komplexe, die an ihre Ziel-DNA binden, zu untersuchen und zu validieren. Daher wird es als der modifizierte Hefe-Ein-Hybrid (Y1.5H) -Assay bezeichnet. Dieser Assay ist kostengünstig und kann in einem regelmäßigen Laboratorium leicht durchgeführt werden. Unter Verwendung eines heterologen Systems könnte die beschriebene Methode ein wertvolles Werkzeug sein, um den heteromeren Proteinkomplex zu testen und zu validieren, der an ihre DNA-Ziel (e) für die funktionelle Genomik in jedem System der Studie, insbesondere der Pflanzengenomik, bindet.

Introduction

Im Allgemeinen, um Protein-DNA-Wechselwirkungen zu verstehen, ist der Y1H-Assay das bevorzugte System, das erfolgreich in einer Laboreinstellung verwendet wird 1 . Der basische Y1H-Assay umfasst zwei Komponenten: a) ein Reporter-Konstrukt mit DNA von Interesse erfolgreich kloniert stromaufwärts eines Gens, das für ein Reporterprotein kodiert; Und b) ein Expressionskonstrukt, das ein Fusionsprotein zwischen dem interessierenden TF und einer Hefe-Transkriptions-Aktivierungsdomäne (AD) erzeugt. Die DNA von Interesse wird gemeinhin als "Köder" bezeichnet, während das Fusionsprotein als "Beute" bekannt ist. In den vergangenen Jahren wurden mehrere Versionen des Y1H-Assays entwickelt, um den spezifischen Bedürfnissen mit ihren eigenen Vorteilen gerecht zu werden 2 . Der bestehende Y1H-Assay kann erfolgreich implementiert werden, um die Interaktion eines Proteins zu einem Zeitpunkt mit seinem DNA-Köder zu identifizieren und zu validieren, aber es fehlt die Fähigkeit, heterodimere oder multimere Protein-DNA-Wechselwirkungen zu identifizieren.

"> Die hier beschriebene Methode ist eine modifizierte Version der vorhandenen Y1H, die es Forschern ermöglicht, gleichzeitig mehrere Proteine ​​zu untersuchen, die an ihre Ziel-DNA-Sequenz (en) binden. Ziel dieses Assays ist es, das Protein von Interesse mit einer Aktivierungsdomäne (pDEST22: TF) und die Aktivierung der an einen Reporter fusionierten Kandidaten-DNA-Regionen in Gegenwart und / oder Abwesenheit des wechselwirkenden Protein-Partners (pDEST32ΔDBD-TF) im Hefe-System aus. Dieser Assay erlaubt es uns zu bestimmen, ob die Wechselwirkung zwischen diesen beiden ist Proteine ​​sind für die Aktivierung des Ziels erforderlich, ein GATEWAY Klonierungs-kompatibles System und daher in einer regelmäßigen Laborumgebung möglich. Das Thisprotokoll basiert auf einer direkten Transformation, die die Einfachheit der Co-Transformation verschiedener TFs in einem Hefe-System ermöglicht So ist es eine vorteilhafte Strategie, die Proteinkomplexe, die an ihre möglichen DNA-Targets binden, für die in vitro molekulare und funktionelle Validierung zu bestimmenOder irgendein System. Aktuelle Techniken wie Tandem Affinitätsreinigung (TAP) sind kostspielig und arbeitsintensiv, erlauben aber den Nachweis von Protein-Hetrocomplexen im großen Maßstab 3 , 4 , 5 . Dieser modifizierte Hefe-Ein-Hybrid kann in einer regelmäßigen Laboreinstellung im kleinen Maßstab erfolgreich durchgeführt werden ( Abbildung 1 ) und ist auch kostengünstig. Der Y1.5H-Assay kann Forschern in der gesamten Gemeinschaft helfen, ihre Hypothese zu testen und zu validieren, um die Rolle der multimeren Protein-Komplexbindung an ein gemeinsames DNA-Ziel unter Verwendung eines heterologen Systems zu definieren. Basierend auf den Befunden konnte die Hypothese in vivo im bevorzugten Studiensystem validiert werden . In letzter Zeit haben wir diesen Ansatz verwendet, um die Rolle eines TF und seiner Wirkungsweise zu definieren, um die Blüte in Arabidopsis zu regulieren 6 .

Protocol

1. Konstruieren und Reporter Plasmid Vorbereitung PCR amplifizieren die Promotorregionen / "Fragmente" (vorzugsweise ~ 250 – 500 bp) der zu analysierenden Ziel-DNA zur weiteren Klonierung in den Eingangsvektor unter Verwendung von E. coli (TOP10). Nach der Sequenzierungsbestätigung subclonieren Sie den positiven Klon in einem kompatiblen pGLacZi-Expressionsvektor 7 wie zuvor beschrieben 8 , 9…

Representative Results

Das allgemeine Plattenaufbauprozess für die Co-Transformation von DNA-Regionen in den Hefezellen mit Protein von Interesse ( Abbildung 2 ). Der Plattenaufbau kann entsprechend der Notwendigkeit des Experiments und der Anzahl der untersuchten DNA-Regionen / Fragmente modifiziert werden. Nach dem Tag-5 des Protokolls sollte eine gut gewachsene und positive Platte sichtbar sein wie in Abbildung 3 . In unserer Studie wurde die Prom…

Discussion

Das bestehende Y1H-Standardverfahren eignet sich zur Identifizierung einer einzigen Protein-Beute-Bindung an seinen DNA-Köder. Mit verschiedenen technischen Modifikationen wurde das bestehende System zur Definition von Transkriptionsregulierungsnetzwerken eingesetzt. Es ist jedoch bekannt, dass TFs als Teil von Komplexen mit zwei oder mehr TFs oder Proteinen fungieren, wobei nur ein Teil der TF an die DNA binden kann. Proteine ​​oder TFs, die nur die Protein-bindenden Domänen besitzen und die Fähigkeit besitzen, …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken SS Wang, M. Amar und A. Galla für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom Nationalen Institut für Allgemeine Medizinische Wissenschaften der National Institutes of Health unter den Auszeichnungsnummern RO1GM067837 und RO1GM056006 (an SAK) unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar.

Materials

pDEST22 vector Invitrogen PQ1000101 Pro-Quest Two hybrid system kit
pDEST32delatDBD Invitrogen PQ1000102 Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Invitrogen K240020
YM4271 Strain Clontech K1603-1 MATCHMAKER One-Hybrid System
pEXP-AD502 Invitrogen PQ1000101 Pro-Quest Two hybrid system kit
GATEWAY LR Clonase II enzyme mix Invitrogen 11791020
YPDA media Clontech 630410
SD-Agar Clontech 630412
SD minimal media Clontech 630411
Uracil DO Supplement Clontech 630416
Tryptophan Do Supplement Clontech 630413
Tris Base Fisher Scientific BP152-1
EDTA Fisher Scientific S311-500
LiAc Sigma-Aldrich L4158
Saplmon Sperm (10mg/ml) Invitrogen 15632011
96 well round bottom Plate Greiner bio-one 650101
PEG3350 Sigma-Aldrich 1546547
96-deep well block USA Scientific 1896-2000
Sealable Foil USA Scientific 2923-0110
Araseal Excel Scientific B-100
2-mercaptoethanol Fisher Scientific 034461-100
ONPG Sigma-Aldrich 73660
Na2CO3 Sigma-Aldrich 223484
Na2HPO4  Sigma-Aldrich S3264
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S3139
KCL Fisher Scientific BP366-500
MgSO4  Sigma-Aldrich 83266
HCL Fisher Scientific SA54-4
Drybath Thermo Fischer
Voretx Thermo Fischer
Centrifgue Eppendorf Centrifuge 5810R
Plate Reader Molecular Device SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer
Incubator Thermo Fisher Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees
Shaker Incubator New Brunswick
Water Bath Thermo Fisher IsoTemp 205
Puncher
50 ml Falocn BD Falcon
Beaker Nalgene
Flask Nalgene
Petriplates (150mm) Greiner bio-one

Referencias

  1. Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
  2. Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
  3. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  4. Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  5. Gavin, A. -. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  6. Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
  7. Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
  8. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
  9. Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
  10. Klein, P., Dietz, K. -. J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
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Citar este artículo
Tripathi, P., Pruneda-Paz, J. L., Kay, S. A. A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies. J. Vis. Exp. (125), e56080, doi:10.3791/56080 (2017).

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