Summary

A الخميرة تعديل واحد نظام هجين ل هيتيروميريك البروتين مجمع دنا التفاعل الدراسات

Published: July 24, 2017
doi:

Summary

الخميرة المعدلة اختبار واحد الهجين وصفها هنا هو امتداد الخميرة الكلاسيكية واحد الهجين (Y1H) فحص لدراسة والتحقق من صحة البروتين هيتيروميريك معقدة التفاعل الحمض النووي في نظام غير متجانسة لأي دراسة الجينوم وظيفية.

Abstract

على مر السنين، وقد أثبتت الخميرة اختبار واحد الهجين لتكون تقنية هامة لتحديد والتحقق من التفاعلات المادية بين البروتينات مثل عوامل النسخ (تفس) وهدف الحمض النووي. الطريقة المعروضة هنا تستخدم المفهوم الأساسي لل Y1H ولكن يتم تعديلها كذلك لدراسة والتحقق من صحة المجمعات البروتين ملزمة للحمض النووي المستهدف. وبالتالي، فإنه يشار إلى الخميرة المعدلة واحد الهجين (Y1.5H) فحص. هذا الفحص هو فعالة من حيث التكلفة ويمكن تنفيذها بسهولة في إعداد المختبر العادية. على الرغم من استخدام نظام غير متجانسة، يمكن أن تكون الطريقة الموصوفة أداة قيمة لاختبار والتحقق من صحة بروتين هتيروميريك مجمع ملزم لهدفها (ق) الحمض النووي لعلم الجينوم وظيفية في أي نظام للدراسة، وخاصة الجينوم النبات.

Introduction

بشكل عام، لفهم التفاعلات البروتين الحمض النووي، وفحص Y1H هو النظام المفضل تستخدم بنجاح في إعداد مختبر 1 . يتضمن مقايسة Y1H الأساسية عنصرين: أ) بناء مراسل مع الحمض النووي من الفائدة المستنسخة بنجاح المنبع من الجينات ترميز بروتين مراسل. و ب) بناء التعبير الذي سيولد البروتين الانصهار بين تف الفائدة ومجال تنشيط النسخ الخميرة (أد). ويشار إلى الحمض النووي من الفائدة عادة باسم "الطعم" في حين أن البروتين الانصهار المعروف باسم "فريسة". في السنوات الماضية، وقد وضعت إصدارات متعددة من مقايسة Y1H لتناسب احتياجات محددة مع مزاياها الخاصة 2 . ويمكن تنفيذ مقايسة Y1H الحالية بنجاح لتحديد والتحقق من صحة التفاعل من بروتين واحد في وقت واحد مع الطعم الحمض النووي، ولكن يفتقر إلى القدرة على تحديد هيتيروديمريك أو مولتيمريك التفاعلات الحمض النووي البروتين.

"> الطريقة الموصوفة هنا هي نسخة معدلة من Y1H القائمة تمكن الباحثين من دراسة البروتينات المتعددة في الوقت نفسه ملزمة لتسلسل الحمض النووي المستهدف لها.والهدف من هذا الفحص هو التعبير عن البروتين من الاهتمام مع مجال التنشيط (pDEST22: تف) وتقييم تفعيل مناطق الحمض النووي المرشح تنصهر لمراسل في وجود و / أو عدم وجود شريك البروتين التفاعل (pDEST32ΔDBD-تف) في نظام الخميرة، وهذا الفحص يسمح لنا لتحديد ما إذا كان التفاعل بين هذين هناك حاجة إلى البروتينات لتنشيط الهدف.هذا هو نظام متوافق الاستنساخ غيتيواي، وبالتالي من الممكن استخدامها في إعداد المختبر العادية.وتستند هذه ثروبوتروكول على التحول المباشر، والذي يوفر سهولة التحول المشترك لمختلف تفس في نظام الخميرة ، وبالتالي، فإنه هو استراتيجية مفيدة للتحقق من صحة المجمعات البروتين ملزمة لأهداف الحمض النووي المحتملة لفي المختبر الجزيئية والتحقق وظيفية وأو أي نظام. التقنيات الحالية مثل طرق تقارب جنبا إلى جنب (تاب) أساليب مكلفة والعمل كثيفة ولكن تسمح الكشف عن البروتين هيتروكومبلكسس على نطاق واسع 3 ، 4 ، 5 . هذا الخميرة المعدلة واحد الهجين يمكن أن يؤديها بنجاح في إعداد مختبر منتظم على نطاق صغير ( الشكل 1 ) وأيضا فعالة من حيث التكلفة. يمكن لفحص Y1.5H تسهيل الباحثين في جميع أنحاء المجتمع لاختبار والتحقق من صحة فرضيتهم نحو تحديد دور البروتين مولتيمريك معقدة ملزمة هدف الحمض النووي المشترك باستخدام نظام غير متجانسة. واستنادا إلى النتائج، يمكن التحقق من صحة الفرضية في الجسم الحي في النظام المفضل للدراسة. في الآونة الأخيرة، استخدمنا هذا النهج لتحديد دور تف وطريقة عملها لتنظيم المزهرة في أرابيدوبسيس 6 .

Protocol

1. إنشاء والمراسل إعداد البلازميد ير تضخيم مناطق المروج / "شظايا" (ويفضل ~ 250 – 500 نقطة أساس) من الحمض النووي المستهدف ليتم تحليلها لمزيد من الاستنساخ في ناقلات دخول باستخدام E. القولونية (TOP10). <li style=";text-align:ri…

Representative Results

إعداد لوحة العامة الإجراء لإجراء التحول المشترك من مناطق الحمض النووي في خلايا الخميرة مع البروتين من الفائدة ( الشكل 2 ). يمكن إعداد لوحة المتابعة وفقا للحاجة إلى التجربة وعدد من مناطق الحمض النووي / شظايا اختبارها. بعد يوم 5 من البرو?…

Discussion

الإجراء القياسي Y1H الحالي هو مناسبة لتحديد فريسة واحدة من البروتين فريسة ملزمة لطعم الحمض النووي. مع التعديلات الفنية المختلفة، تم تسخير النظام الحالي لتحديد الشبكات التنظيمية النسخي. ومع ذلك، من المعروف أن تفس تعمل كجزء من المجمعات التي تنطوي على اثنين أو أكثر من ت?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر سس وانغ، M. عمار و A. غالا على قراءة نقدية للمخطوطة. تم دعم البحوث الواردة في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة RO1GM067837 و RO1GM056006 (إلى ساك). المحتوى هو فقط من مسؤولية المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

pDEST22 vector Invitrogen PQ1000101 Pro-Quest Two hybrid system kit
pDEST32delatDBD Invitrogen PQ1000102 Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Invitrogen K240020
YM4271 Strain Clontech K1603-1 MATCHMAKER One-Hybrid System
pEXP-AD502 Invitrogen PQ1000101 Pro-Quest Two hybrid system kit
GATEWAY LR Clonase II enzyme mix Invitrogen 11791020
YPDA media Clontech 630410
SD-Agar Clontech 630412
SD minimal media Clontech 630411
Uracil DO Supplement Clontech 630416
Tryptophan Do Supplement Clontech 630413
Tris Base Fisher Scientific BP152-1
EDTA Fisher Scientific S311-500
LiAc Sigma-Aldrich L4158
Saplmon Sperm (10mg/ml) Invitrogen 15632011
96 well round bottom Plate Greiner bio-one 650101
PEG3350 Sigma-Aldrich 1546547
96-deep well block USA Scientific 1896-2000
Sealable Foil USA Scientific 2923-0110
Araseal Excel Scientific B-100
2-mercaptoethanol Fisher Scientific 034461-100
ONPG Sigma-Aldrich 73660
Na2CO3 Sigma-Aldrich 223484
Na2HPO4  Sigma-Aldrich S3264
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S3139
KCL Fisher Scientific BP366-500
MgSO4  Sigma-Aldrich 83266
HCL Fisher Scientific SA54-4
Drybath Thermo Fischer
Voretx Thermo Fischer
Centrifgue Eppendorf Centrifuge 5810R
Plate Reader Molecular Device SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer
Incubator Thermo Fisher Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees
Shaker Incubator New Brunswick
Water Bath Thermo Fisher IsoTemp 205
Puncher
50 ml Falocn BD Falcon
Beaker Nalgene
Flask Nalgene
Petriplates (150mm) Greiner bio-one

Referencias

  1. Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
  2. Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
  3. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  4. Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  5. Gavin, A. -. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  6. Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
  7. Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
  8. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
  9. Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
  10. Klein, P., Dietz, K. -. J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
  11. Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
  12. Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
  13. Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).

Play Video

Citar este artículo
Tripathi, P., Pruneda-Paz, J. L., Kay, S. A. A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies. J. Vis. Exp. (125), e56080, doi:10.3791/56080 (2017).

View Video