Модифицированная дрожжевая гибридная система для исследований комплексных ДНК-гетерогенных белков
Summary
Модифицированный дрожжевой одногибридный анализ, описанный здесь, является расширением классического дрожжевого одногибридного (Y1H) анализа для изучения и проверки гетеромерного белкового комплекса-ДНК-взаимодействия в гетерологичной системе для любого исследования функциональной геномики.
Abstract
На протяжении многих лет дрожжевой одногибридный анализ оказался важным методом идентификации и подтверждения физических взаимодействий между белками, такими как транскрипционные факторы (ТФ) и их ДНК-мишень. Представленный здесь метод использует основную концепцию Y1H, но модифицируется далее для изучения и проверки связывания белковых комплексов с их ДНК-мишенью. Следовательно, он упоминается как модифицированный дрожжевой одногибридный (Y1.5H) анализ. Этот анализ экономичен и может быть легко выполнен в обычной лабораторной обстановке. Несмотря на использование гетерологичной системы, описанный способ может быть ценным инструментом для проверки и проверки связывания гетеромерного белкового комплекса с их ДНК-мишенью (ами) для функциональной геномики в любой системе исследования, особенно в геноме растений.
Introduction
В общем, для понимания взаимодействия белок-ДНК анализ Y1H является предпочтительной системой, успешно используемой в лабораторных условиях 1 . Основной анализ Y1H включает в себя два компонента: а) репортерную конструкцию с интересной ДНК, успешно клонированной выше гена, кодирующего репортерный белок; И b) конструкцию экспрессии, которая будет генерировать слитый белок между TF интересом и доменом активации транскрипции (AD). Интересную ДНК обычно называют «приманкой», в то время как слитый белок известен как «жертва». В прошлые годы были разработаны несколько вариантов анализа Y1H с учетом особых потребностей 2 . Существующий анализ Y1H может быть успешно реализован для идентификации и подтверждения взаимодействия одного белка за один раз с его приманкой ДНК, но не обладает способностью идентифицировать гетеродимерные или мультимерные белковые ДНК-взаимодействия.
«> Метод, описанный здесь, представляет собой модифицированную версию существующих Y1H, позволяющих исследователям одновременно изучать множественные белки, связывающиеся с их последовательностью (ами) ДНК-мишени. Целью этого анализа является выражение интересующего белка с доменом активации (pDEST22: TF) и оценивают активацию областей ДНК-кандидатов, слитых с репортером, в присутствии и / или отсутствии взаимодействующего белкового партнера (pDEST32ΔDBD-TF) в дрожжевой системе. Этот анализ позволит нам определить, является ли взаимодействие между этими двумя Белки необходимы для активации мишени.Это совместимая с клонированием система GATEWAY, и поэтому ее можно использовать в обычной лабораторной установке.Этопротокол основан на прямой трансформации, что обеспечивает легкость коразрушения различных ТФ в дрожжевой системе Таким образом, выгодной стратегией является проверка связывания белковых комплексов с их возможными целями ДНК для молекулярной и функциональной валидации in vitro fИли любой системы. Современные методы, такие как методы тандемой аффинной очистки (TAP), являются дорогостоящими и трудоемкими, но позволяют обнаруживать белковые гетерокомплексы в больших масштабах 3 , 4 , 5 . Этот модифицированный дрожжевой гибрид может быть успешно выполнен в обычной лабораторной обстановке в небольшом масштабе ( рисунок 1 ), а также экономически эффективен. Анализ Y1.5H может помочь исследователям всего сообщества проверить и обосновать свою гипотезу в отношении определения роли связывания многомерного белкового комплекса с общей ДНК-мишенью с использованием гетерологичной системы. Основываясь на полученных данных, гипотеза может быть подтверждена in vivo в предпочтительной системе исследования. В последнее время мы использовали этот подход для определения роли ТФ и его способа действия для регулирования цветения в Arabidopsis 6 .Protocol
Representative Results
Discussion
Существующая стандартная процедура Y1H подходит для идентификации единственной белковой жертвы, связывающей ее ДНК-приманку. С различными техническими изменениями существующая система была использована для определения сетей регулирования транскрипции. Однако известно, что TF функци?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим С.С. Ванга, М. Амара и А. Галла за критическое чтение рукописи. Исследования, опубликованные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом общих медицинских наук Национального института здоровья по номерам премий RO1GM067837 и RO1GM056006 (до SAK). Контент принадлежит исключительно авторам и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здоровья.
Materials
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
Referencias
- Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
- Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Gavin, A. -. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
- Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
- Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
- Klein, P., Dietz, K. -. J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
- Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
- Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
- Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).
