We beschrijven hier een minimaal invasieve laparoscopische techniek voor periodieke bemonstering van de lever en mesenteriale lymfeknopen (MLN) bij makaken waarmee verhoogde bemonsteringsfrequentie, en vermindert de kans op operatieve complicaties in vergelijking met het uitvoeren van een laparotomie.
De mesenteriale lymfeknopen (MLN) en de lever worden blootgesteld aan microben en microbiële producten uit de gastro-intestinale (GI) stelsel, waardoor ze immunologisch uniek. Het maagdarmkanaal en bijbehorende MLN zijn sites vroege virale replicatie in humane immunodeficiëntie virus (HIV) en het MLN waarschijnlijk belangrijk reservoir sites die latent geïnfecteerde cellen zelfs na langdurige antiretrovirale therapie (ART) haven. De lever is aangetoond dat het een belangrijke rol bij immuun responsen op lentivirussen en blijkt een belangrijke rol spelen in de klaring van het virus uit de bloedsomloop. Niet-menselijke primaten (NHP) modellen voor HIV en Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) lijken sterk op deze aspecten van HIV-infectie en periodieke longitudinale bemonstering van primaire gebieden van virale replicatie en de bijbehorende immuunresponsen bij dit model zal helpen om kritieke gebeurtenissen in infectie helderen pathogenese en de impact van verschillende interventiestrategieën op deze gebeurtenissen. Current gepubliceerde technieken lever bemonsteren en MLN samen omvatten een grote operatie en / of necropsie, die het vermogen om deze belangrijke plaatsen op seriële wijze onderzocht bij hetzelfde dier beperkt. We hebben eerder beschreven een laparoscopische techniek voor het verzamelen van MLN. We beschrijven hier een minimaal invasieve laparoscopische techniek voor seriële longitudinale bemonstering van lever en MLN door dezelfde twee poortlocaties vereist voor het verzamelen van MLN. Het gebruik van dezelfde twee poorten minimaliseert de impact op de dieren geen extra incisies nodig. Deze techniek kan worden gebruikt met een verhoogde bemonsteringsfrequentie vergeleken met een grote buikoperatie en vermindert de kans op operatieve complicaties en bijbehorende lokale en systemische ontstekingsreacties die de interpretatie van de resultaten zou kunnen bemoeilijken. Deze procedure heeft potentieel om studies met NHP modellen terwijl het verbeteren van het welzijn van dieren te bevorderen.
Het gastro-intestinale (GI) kanaal is het lichaam grootste mucosale oppervlak wordt blootgesteld aan een groot aantal antigenen afkomstig uit voedsel, ziekteverwekkers en endosymbiontische bacteriële gewoonlijk aangeduid als microbiome 1, 2. Mesenterische lymfeknopen (MLN) lijn het maagdarmkanaal en zijn voornaamste plaats van immuunfunctie te bevorderen ontstekings- of tolerogene reacties bij deze verschillende antigenen. De fysieke ordening van de MLN creëert een in compartimenten systeem dat kan reageren op antigenen lokaal opwekken zonder systemische responsen 3. Ook het bloed uit het spijsverteringskanaal afvoeren naar de lever via de poortader alvorens terug te keren om de bloedsomloop, en is dus blootgesteld aan microben en microbiële producten die uit het spijsverteringskanaal hebben translocatie in de lamina propria en ging de bloedbaan 4. De lever functioneert ook als secundaire lymfe-organen eennd heeft een groot aantal immuuncellen, waaronder gespecialiseerde macrofagen, om translocatie microben 5, 6 te verwijderen. Dus de MLN en de lever het primaire immuunorganen blootgesteld aan commensale en pathogene bacteriën van het maagdarmkanaal, en het milieu van antigenen uit andere bronnen, waardoor ze uniek en belangrijk vanuit een immunologisch perspectief.
De MLN zijn kritisch plaatsen voor de evaluatie van de virologische en immunologische effecten van menselijke immunodeficiency virus (HIV) of pathogene simian immunodeficiency virus (SIV) infectie, en zijn waarschijnlijk betrokken in de vroege verspreiding van SIV na intrarectale uitdaging. -Darm-geassocieerd lymfeweefsel is bekend als een belangrijke plaats van persistent HIV replicatie ondanks effectieve controle van viremie moderne antiretrovirale therapie (ART) 7. SIV infectie modellen hebben aangetoond dat MLN belangrijke reservoirs van latent virus en kande primaire reservoir 8, 9. De lever is ook belangrijk lentivirale infectie bewezen door de accumulatie van SIV specifieke CD8 + T cellen in de levers van makaken tijdens acute SIV-infectie 10. Verder is het de belangrijkste orgaan verantwoordelijk voor het opruimen van het virus uit de omloop 11.
HIV en SIV-infectie zijn geassocieerd met veranderde GI microbiota, verstoord GI epitheel integriteit en verhoogde translocatie van microben en microbiële producten van de dikke darm in de perifere circulatie en 12, 13. Deze processen zijn geassocieerd met de lokale en systemische immunologische activering en verhoogde morbiditeit en mortaliteit bij HIV geïnfecteerde individuen 14. SIV-infectie, zijn translocatie bacteriën waargenomen in de MLN 15, terwijl de accumulatie van micRobial producten in de lever is aangetoond dat het resulteert in ontsteking en beschadiging van het orgaan 16. Dus in de context van HIV en SIV infecties, de MLN en lever kan zeer informatief zijn voor het begrijpen van de ontstekingsprocessen aangedreven door GI-resident bacteriën.
Hier presenteren we een minimaal invasieve laparoscopische techniek voor periodieke bemonstering van de MLN en lever bij niet-humane primaten (NHP's). We demonstreren succesvolle uitvoering van deze techniek op twee gezonde vrouwelijke rhesus makaken (RMS), het bemonsteren van elk dier twee keer, met 160 dagen tussen elke operatie. We gaan op deze monsters te gebruiken om zeer consistente gegevens tussen de twee tijdstippen evalueren en vergelijken sleutel leukocyten en lymfocyten populaties in elk orgaan met behulp van flowcytometrie, en demonstreren.
Hier tonen we een minimaal invasieve techniek voor seriële collectie van MLN en leverbiopten dat een 100% succes in deze en andere dieren die niet in deze studie beschreven gehad. Verder gebruik van deze techniek bij dezelfde dieren in de tijd niet geassocieerd met enige bijwerkingen. Inderdaad zijn er geen complicaties als gevolg van het gebruik van deze techniek in andere cohorten van dieren die waren geïnfecteerd met SIV, simian / human immunodeficiency virus (SHIV) of Zika virus (ongepubliceerde gegevens) geweest. Evenzo is deze operatie succesvol gebleken, zelfs bij dieren die eerder een grote buikoperatie hadden ondergaan, en in trombocytopenische dieren (niet-gepubliceerde gegevens). We hebben aangetoond dat deze monsters kunnen worden verzameld via dezelfde twee havens door het omkeren van de camera locatie bij het overschakelen van MLN aan de lever vermijden van de behoefte aan extra incisies. Factoren die van invloed de collectie van MLN zijn eerder gerapporteerd 13.
<pclass = "jove_content"> Tot vier collecties van 3 MLN en 3 leverbiopten elk zijn uitgevoerd in de tijd op de individuele dieren zonder complicaties, veranderingen in de slagingspercentages, of wijzigingen in de gegevens die zijn verzameld. Bovendien is deze laparoscopische MLN / leververzamelingskast techniek is succesvol gecombineerd met andere werkwijzen zoals het verzamelen van perifere LN, endoscopische bovenste en onderste MD biopsieën, beenmergaspiratie, cerebrospinale vloeistof verzamelen en venapunctie bij dezelfde narcose gebeurtenis waardoor uitgebreide evaluatie van virologische en immunologische responsen op seriële wijze (ongepubliceerde gegevens).De gehele procedure duurt gewoonlijk 30-45 minuten in beslag en wordt bereikt door twee -0,5 cm incisies. Bij obese dieren, kan het nodig zijn om een grotere incisie (~ 1-1,5 cm) te halen MLN door en kan extra tijd in beslag nodig. Dieren met uitgebreide mesenteriale vet vereisen vaak aanzienlijke ervaring op differentiate MLN uit de omliggende vet. MLN zijn vaak te vinden langs de mesenteriale vaatstelsel en lijken vaker in de buurt van tak punten in de vaten te zijn. Een kritisch aspect van deze techniek is dat het geselecteerde MLN voldoende mobiliteit in het mesenterium wordt naar buiten gebracht door de abdominale incisie. Dientengevolge kan deze techniek niet worden gebruikt om MLN dichtbij de wortel van het mesenterium verzamelen. Als gevolg van de vergroting, is het soms makkelijker om MLN identificeren met de camera, en grijpen in de nabijheid van de MLN kan helpen bij het opsporen en identificeren van het knooppunt zodra deze is naar buiten genomen.
Gebruik van de Trendelenburg positie niet altijd vereist voor MLN verzamelen, en als MLN eenvoudig terug te vinden zonder het gebruik van Trendelenburg positie kan het leverbiopten makkelijker het zal voorkomen dat de organen verschuiven craniaal te maken. Soms, na plaatsing in Trendelenburg, de lever verschoven tegen het membraan en most worden voorzichtig terug op zijn plaats voorafgaand aan biopsie collectie gemanipuleerd. Als poort plaatsing voor het verzamelen MLN naar links worden leverbiopten kenmerkend uit de linker laterale en mediale linker leverlobben aangezien zij dichter bij de canule.
MLN verzameld en leverbiopten voorwaarde dat voldoende celopbrengsten voor verschillende stroomafwaartse analyses en vertoonden hoge levensvatbaarheid van de verzamelde cellen. Hier werden de cellen gekleurd voor flowcytometrische analyse van leukocyten en lymfocyten populaties en belangrijkste verschillen tussen deze twee belangrijke immuunorganen opgehelderd. Zo werden de MLN sterk verrijkt op CD4 + T-cellen vergeleken met de lever, gezien het belang van de MLN als centrale punten voor het verzamelen en verspreiden van adaptieve immuunreacties, alsmede het belang van CD4 + T voor het beheren inflammatoire en tolerogene respons op het milieu antigenen afgeleid van inname en GI-resident microorganismens = "xref"> 24. Nochtans, werd de lever aanzienlijk verrijkt op CD14 + leukocyten in vergelijking met de MLN. CD14 wordt voornamelijk tot expressie gebracht op monocyten en macrofagen en is een belangrijk onderdeel van het receptorcomplex voor bacterieel lipopolysaccharide (LPS) 25. Inderdaad, verhoogde plasmaconcentraties van oplosbaar CD14 worden geassocieerd met microbiële translocatie en immuun activatie van HIV en SIV pathogene infecties 26. Aldus hogere frequenties van CD14 + leukocyten in de lever waarschijnlijk resulteren uit een grotere bacteriële belasting in dit orgaan in vergelijking met de MLN.
Hier tonen we een snelle en minimaal invasieve chirurgische techniek voor seriële collectie van MLN en de lever biopten met behulp van slechts twee kleine incisies voor laparoscopische vermelding die niet heeft geleid tot negatieve resultaten. Deze monsters een bruikbare route om belangrijke immunologische, virologische en microbiologische processen die pla nemen evaluerence in de MLN en lever, die afzonderlijke en unieke aan systemische immuniteit. Ook lever biopten zijn van cruciaal belang voor de evaluatie van de gevolgen van HIV / SIV, drug therapieën, en translocatie microben, die vaak worden gecombineerd om aanzienlijke schade aan de lever 16 induceren op lange termijn. Verder, omdat de MLN en de lever zijn immuunorganen blootgesteld aan GI microbiota, de mogelijkheid om immuniteit in deze organen in de tijd te evalueren biedt een uitstekend platform voor het begrijpen van de rol die de microbiome speelt bij het handhaven van gastheer immuun homeostase. Bij elkaar genomen, de evaluatie van de lever en MLN is van groot belang in het kader van het vaccin en therapeutische werkzaamheden, SIV virale reservoir ontruiming, en algemene mucosale immuniteit. De mogelijkheid om deze monsters te verzamelen door middel van een minimaal invasieve benadering houdt in dat er minder risico van ontsteking in verband met de procedure dan bestaat met de huidige gepubliceerde technieken en minder impact op de fysiologie van de dieren. In de futuur, zullen we het potentieel evalueren om het verzamelen van MLN en de lever met de inning van de milt combineren door middel van dezelfde twee poort locaties mogelijk te maken voor de bemonstering van een ander belangrijk en onderscheiden deel van het immuunsysteem dat is aangetoond dat het een belangrijke rol spelen in een aantal ziektemodellen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de NIH-subsidie nummer P51OD010425.
Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
Hospira Lactated Ringer's 250 ml | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
Multipurpose Rigid Scope, 2.7mm x 187.5mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
Exam and Protective Sheath for 2.7mm x 187.5mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
Rigid scope, 5mm x 300mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
Veress Needle, 2mm x 80mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
Solid Probe with Markings, 5mm x 320mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5mm x 240mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
Biopsy Forceps, 3.5mm X 310mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
CO2 | Airgas | CD USPE | |
RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
5mL Syringe | BD | 309646 | |
50mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
5mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
LSR II Flow Cytometer | BD | NA |