在这里,我们描述了用于在猕猴肝脏和肠系膜淋巴结(MLN)的连续取样,可以增加采样频率,并与执行剖腹时减少了手术并发症的潜力微创腹腔镜技术。
的肠系膜淋巴结(MLN)和肝脏暴露于从胃肠(GI)道的微生物和微生物产物,使它们免疫唯一的。胃肠道和相关MLN是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染早期病毒复制的站点和MLN是怀有即使经过长时间的抗逆转录病毒疗法(ART)潜伏感染的细胞可能重要的水库遗址。肝脏已经显示出在免疫反应中显著作用,慢病毒,并出现在流通病毒的清除发挥显著作用。非人灵长类动物(NHP)模型,艾滋病毒和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)紧密地模仿HIV感染和病毒的复制,并在这个模型中与之相关的免疫应答的原发部位的序列纵向抽样的这些方面将有助于阐明感染的关键事件,发病机制,以及对这些事件的各种干预策略的影响。 CURR耳鼻喉科已公开的技术来样肝和MLN一起涉及重大手术和/或剖检,这限制了调查以串行方式这些重要站点在同一动物的能力。之前我们已经描述的腹腔镜技术用于MLN的集合。在这里,我们描述了通过用于MLN的收集所需的相同的两个端口位置为肝脏和MLN的串行纵向采样微创腹腔镜技术。使用相同的两个端口作为不需要额外切口影响最小的动物。这种技术可以增加采样频率可用于比较大的腹部手术,减少了手术并发症的可能性和相关的可能复杂化结果的解释局部和全身炎症反应。这个过程有潜力促进涉及NHP模型,同时提高动物福利的研究。
胃肠(GI)道是人体最大的粘膜表面和暴露于从食品,病原体和内共生细菌群落衍生抗原的无数通常被称为微生物组1,2。肠系膜淋巴结(MLN)排列在胃肠道和是免疫功能的用于促进对这些不同的抗原炎性或致耐受性反应的主要位点。在MLN的物理组织创建了一个隔间系统,可以在本地而不会引起全身反应3抗原反应。同样,血液从胃肠道排至通过门静脉的方式肝脏返回到循环,并因此暴露于从胃肠道易位到固有层和进入血流4的微生物和微生物产品之前。肝还用作二级淋巴器官中一第二有大量免疫细胞,包括专门巨噬细胞,以去除易位微生物5,6。因此,MLN和肝脏是从胃肠道暴露于共生和病原性细菌的主要免疫器官,以及来自其它来源的抗原的环境,使得它们独特和重要的从免疫学的观点。
该MLN是人类免疫缺陷病毒(HIV)或致病性的猴免疫缺陷病毒(SIV)感染的病毒学和免疫效果评价的关键点,并有可能涉及以下直肠挑战SIV的早期传播。肠道淋巴组织被称为是持久的HIV复制的主要场所,尽管现代的抗逆转录病毒治疗(ART)7有效控制病毒血症。在SIV感染模型,MLN已被证明是潜在的病毒的重要水库和可能是主要的贮存器8,9。肝脏也是慢病毒感染重要由SIV特异性CD8 + T细胞在猕猴肝脏的急性SIV感染10在累积所证实。此外,负责从循环11清除病毒的主要器官。
HIV和SIV感染与改变的GI微生物群相关联,打乱GI上皮完整性和增加的微生物和微生物产物的易位从结肠到周边和循环12,13。这些过程与局部和全身免疫激活有关,在HIV感染的个体14增加发病率和死亡率。在SIV感染,易位细菌已经在MLN 15观察到的,而麦克风的积累robial产品在肝脏已显示导致炎症和损害器官16。因此,在HIV和SIV感染的上下文中,MLN和肝可以是用于理解通过GI-常住菌驱动的炎性过程高度信息。
这里,我们提出了用于在非人类灵长类动物(NHP中)的MLN的连续取样和肝脏微创腹腔镜技术。我们证明两个健康雌性恒河猴(RMS)这一技术的成功表现,采样每个动物的两倍,为160天,每个手术间。我们继续使用这些样本来评估并用流式细胞仪检测各器官中比较关键的白细胞和淋巴细胞群体,并展示了两个时间点之间的高度一致的数据。
这里,我们证明了MLN的串行收集和肝活检微创技术,曾在本研究中没有描述这些和其他动物100%的成功率。此外,跨时间对同一动物使用这种技术还没有与任何不良事件。事实上,已经有因使用这一技术在动物体内的其他同伙感染了SIV,猿/人类免疫缺陷病毒(SHIV),或兹卡病毒(未公布数据)而导致的任何并发症。同样,这种手术甚至在曾接受腹部大手术,动物和动物的血小板(未公布数据)证明是成功的。我们证明,这些样品可以通过相同的两个端口通过倒车摄像头的位置,距离MLN切换到肝脏,避免额外的切口需要时收集。影响MLN收集因素已有报道13。
<p类=“jove_content”>最多的每3个MLN和3肝活检4个集已经跨越时空,无并发症被执行的动物个体,改变的成功率,或改变数据收集。此外,该腹腔镜MLN /肝收集技术已经成功地与其他程序如外周淋巴结,内窥镜上和下GI活检,骨髓穿刺,脑脊液采集的采集,和静脉穿刺在相同的麻醉事件允许的广泛评估组合病毒学和以串行方式免疫反应(未发表数据)。整个过程通常需要30 – 45分钟来完成,并通过2〜0.5厘米切口来完成的。在肥胖动物,可能有必要使一个较大的切口(〜1 – 1.5厘米),以检索MLN通过,并且可能需要额外的时间来完成。具有丰富的肠系膜脂肪的动物常常需要到D显著经验从周围的脂肪ifferentiate万。 MLN往往沿肠系膜血管中发现,似乎是在附近的血管分支点更为普遍。这种技术的一个重要方面是,它要求所选择的MLN具有足够的流动性在肠系膜通过腹部切口被外置。其结果是,该技术不能被用来收集MLN靠近肠系膜根部。由于放大,它是有时容易与摄像头,以确定MLN,并在靠近抓的MLN可以定位和识别节点一旦外置帮助。
在头低脚高位的使用可能并不总是需要MLN集合,如果MLN可在不使用的头低脚高位轻松地检索它能使肝活检更容易,因为它会阻止器官从头侧转移。有时,在头低脚高位放置后,肝脏上移向膜和绝轻轻地操纵回活检前收集位置。作为MLN采集端口的位置是在左边,肝脏活组织检查典型地从左侧横向和左内侧肝叶作为它们更接近插管。
收集MLN和肝脏活组织检查提供充足的细胞产量为各种下游分析的,并显示所收集的细胞的高生存力。在这里,细胞进行染色白细胞和淋巴细胞群的流式细胞仪分析,这两个重要的免疫器官之间的主要差异,阐明。例如,MLN高度富集为相比于肝CD4 + T细胞,由于MLN作为用于收集和传播适应性免疫应答,以及对CD4 + T的重要性中心点的重要性用于管理炎性和到环境致耐受性抗原的响应从饮食中摄取和GI-驻留微生物的S = “外部参照”> 24。然而,肝显著富集CD14 +白细胞相比万。 CD14主要表达在单核细胞和巨噬细胞,并且是受体复合物对细菌脂多糖(LPS)25的一个关键组成部分。实际上,增加了可溶性CD14的血浆浓度与微生物移位和在HIV免疫激活和病原感染SIV 26相关联。因此,相比于当MLN在肝脏中CD14 +白细胞较高频率可能在从该器官更大的细菌负荷的结果。
这里,我们证明了MLN的串行收集和使用只有两种腹腔镜条目并没有导致任何不良后果的小切口肝活检快速,微创手术技术。这些样品提供了一个有用的途径,以评估采取解放军关键免疫,病毒学,和微生物方法CE在MLN和肝脏,这是从系统免疫单独且唯一的。类似地,肝脏活组织检查是用于HIV / SIV,药物疗法,和易位微生物的作用,这常常结合诱导显著肝损伤16长期评价是至关重要的。此外,由于MLN和肝脏暴露于GI微生物免疫器官的能力,以评估跨越时间在这些器官的免疫提供了理解的是,微生物在维持机体免疫稳态中扮演的角色一个很好的平台。总之,肝脏的评价和MLN是非常重要的疫苗和治疗疗效,SIV病毒清除水库,和一般的粘膜免疫的情况下。通过微创方法来收集这些样品的能力意味着存在与比目前公布的技术和对动物的生理影响较小存在的程序炎症的风险。在福TURE,我们将评估潜在的通过相同的两个端口位置,以MLN的收集和肝与脾的收集相结合,以便对已被证明在发挥显著作用,对免疫系统的另一个重要的不同部分的采样许多疾病模型。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由美国国立卫生研究院授权号P51OD010425支持。
Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
Hospira Lactated Ringer's 250 ml | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
Multipurpose Rigid Scope, 2.7mm x 187.5mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
Exam and Protective Sheath for 2.7mm x 187.5mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
Rigid scope, 5mm x 300mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
Veress Needle, 2mm x 80mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
Solid Probe with Markings, 5mm x 320mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5mm x 240mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
Biopsy Forceps, 3.5mm X 310mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
CO2 | Airgas | CD USPE | |
RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
5mL Syringe | BD | 309646 | |
50mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
5mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
LSR II Flow Cytometer | BD | NA |