Hier beschreiben wir eine minimal-invasive laparoskopische Technik zur Serien Probenahme von Leber und mesenterischen Lymphknoten (MLN) bei Makaken, die für eine erhöhte Abtastfrequenz ermöglicht, und reduziert das Potential für chirurgische Komplikationen im Vergleich zu einer Laparotomie durchgeführt wird.
Die mesenterischen Lymphknoten (MLN) und die Leber sind Mikroben und mikrobielle Produkte aus dem Magen-Darm-Trakt (GI) ausgesetzt, so dass sie immunologisch einzigartig. Die GI-Trakt und die damit verbundenen MLN sind Websites der frühen viralen Replikation in humanen Immundefizienz-Virus (HIV) Infektion und die MLN sind wahrscheinlich wichtige Reservoir-Sites, die latent infizierten Zellen auch nach längerer antiretrovirale Therapie (ART) beherbergen. Die Leber wurde eine bedeutende Rolle bei Immunantworten auf Lentiviren spielen gezeigt und scheint eine wichtige Rolle bei der Clearance des Virus aus dem Verkehr zu spielen. Nicht-menschlicher Primat (NHP) Modelle für HIV und Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) imitiert eng diese Aspekte der HIV-Infektion und serieller Längs Probenahme von primären Standorten der viralen Replikation und die damit verbundenen Immunantworten in diesem Modell kritische Ereignisse in Infektion aufzuklären helfen, Pathogenese und die Auswirkungen verschiedener Interventionsstrategien auf diese Ereignisse. current veröffentlichten Techniken Leber zu probieren und MLN zusammen beinhaltet eine große Operation und / oder die Obduktion, die die Fähigkeit begrenzt diese wichtigen Standorte auf serielle Weise in demselben Tiere zu untersuchen. Wir haben zuvor beschrieben eine laparoskopische Technik zur Sammlung von MLN. Hier beschreiben wir eine minimal-invasive laparoskopische Technik zur seriellen Längs Probenahme von Leber und MLN durch die beiden gleichen Anschlusspositionen für die Sammlung von MLN erforderlich. Die Verwendung der gleichen zwei Ports minimiert die Auswirkungen auf die Tiere, da keine zusätzlichen Einschnitte erforderlich sind. Diese Technik kann mit einem erhöhten Abtastfrequenz im Vergleich zu größeren Bauchoperationen und reduziert das Potential für chirurgische Komplikationen und die damit verbundene lokale und systemische Entzündungsreaktionen verwendet werden, die Interpretation der Ergebnisse erschweren könnte. Dieses Verfahren hat das Potenzial Studien zu erleichtern NHP-Modelle beteiligt, während den Tierschutz zu verbessern.
Der Magen – Darm – Trakt (GI) ist der größte Schleimhautoberfläche des Körpers und ist mit einer Vielzahl von Antigenen aus der Nahrung, Pathogene und endosymbiotische Bakteriengemeinschaften allgemein bezeichnet als microbiome 1, 2 abgeleitet ausgesetzt. Mesenterischen Lymphknoten (MLN) säumen den GI-Trakt und sind ein Hauptstandort der Immunfunktion zur Behandlung von entzündlichen oder tolerogen Antworten auf diese verschiedenen Antigenen zu fördern. Die physische Organisation des MLN schafft ein compartmentalized System , die systemischen Reaktionen auf Antigene vor Ort reagieren zu können 3 ohne Hervorrufen. In ähnlicher Weise Blut aus den GI – Trakt Abflüsse in die Leber über die Pfortader vor dem Kreislauf zurückkehrt und damit zu Mikroben und mikrobielle Produkte ausgesetzt ist , die aus dem GI – Trakt in die Lamina propria und trat in den Blutkreislauf 4 transloziert haben. Die Leberfunktionen auch als sekundärer Lymphorgane and hat eine große Anzahl von Immunzellen, einschließlich spezialisierten Makrophagen, zu transloziert Mikroben 5 zu entfernen, 6. Somit sind die MLN und die Leber das primäre Immunorgane commensal und pathogene Bakterien aus dem Darm-Trakt ausgesetzt GI, sowie das Milieu von Antigenen aus anderen Quellen, so dass sie einzigartige und wichtige Aus immunologischer Sicht machen.
Die MLN sind kritische Stellen für die Bewertung der virologischen und immunologischen Auswirkungen des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) oder pathogenen Simian Immunodeficiency Virus (SIV) Infektion und sind in der frühen Verbreitung von SIV folgende intrarektale Herausforderung wahrscheinlich beteiligt. Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe ist bekannt , ein wichtiger Standort von persistenten HIV – Replikation sein, trotz wirksame Kontrolle der Virämie durch moderne antiretrovirale Therapien (ART) 7. In SIV-Infektion Modellen wurden MLN gezeigt wichtige Reservoire von latentem Virus zu sein und kannsein , das primäre Reservoir 8, 9. Die Leber ist auch wichtig , in lentivirale Infektion , wie durch die Anhäufung von SIV spezifischen CD8 + T – Zellen in der Leber von Makaken während eines akuten Infektion SIV 10 belegt. Ferner ist es das Hauptorgan für die verantwortliche 11 das Virus aus dem Verkehr zu löschen.
HIV und SIV – Infektion mit veränderter GI microbiota verbunden ist , gestört Integrität GI epitheliale und eine erhöhte Translokation von Mikroben und mikrobielle Produkten aus dem Darm in den Umfang und den Kreislauf 12, 13. Diese Verfahren sind im Zusammenhang mit lokalen und systemischen Immunaktivierung und einer erhöhten Morbidität und Mortalität bei HIV – infizierten Personen 14. In SIV – Infektion haben transloziert Bakterien in MLN der 15, während die Anhäufung von mic beobachtetRobial Produkte in der Leber wurde in der Entzündung und Schädigung des Organs 16 führen , gezeigt. So wird im Kontext von HIV und SIV-Infektionen können die MLN und Leber sehr informativ für die entzündlichen Prozesse von GI-resident Bakterien angetrieben zu verstehen.
Hier präsentieren wir eine minimal-invasive laparoskopische Technik für die serielle Abtastung des MLN und Leber in nichtmenschlichen Primaten (NHP). Wir zeigen erfolgreiche Anwendung dieser Technik auf zwei gesunden weiblichen Rhesusaffen (rms), jedes Tier zweimal Abtasten, mit 160 Tage zwischen jeder Operation. Wir gehen auf diese Proben zu verwenden, um Schlüssel Leukozyten und Lymphozyten-Populationen zu bewerten und zu vergleichen, in jedem Organ Durchflusszytometrie mit und zeigen sehr konsistente Daten zwischen den beiden Zeitpunkten.
Hier zeigen wir eine minimal-invasive Technik für die serielle Sammlung von MLN und Leberbiopsien, die eine 100% Erfolgsquote in diesen und anderen Tieren hatten in dieser Studie nicht beschrieben. Darüber hinaus hat die Verwendung dieser Technik auf den gleichen Tieren über die Zeit nicht mit unerwünschten Ereignissen in Verbindung gebracht worden. Tatsächlich gibt es keine Komplikationen durch Einsatz dieser Technik in anderen Kohorten von Tieren ergeben gewesen, die mit SIV, simian / Human Immunodeficiency Virus (SHIV) oder Zika-Virus (nicht veröffentlichte Daten) infiziert waren. In ähnlicher Weise hat diese Operation als erfolgreich erwiesen, auch bei Tieren, die zuvor große Bauchoperation unterzogen hatten, und in thrombozytopenische Tieren (nicht veröffentlichte Daten). Wir haben gezeigt, dass diese Proben können durch Umkehrung der Kameraposition durch die gleichen zwei Ports gesammelt werden, wenn von MLN Leberschalt die Notwendigkeit für zusätzliche Einschnitte zu vermeiden. Faktoren , die die Sammlung von MLN beeinflussen wurden bisher 13 gemeldet.
<pclass = „jove_content“> Bis zu vier Sammlungen von 3 MLN und 3 Leberbiopsien wurden jeweils ohne Komplikationen auf einzelne Tiere über die Zeit durchgeführt worden ist, Veränderungen in den Erfolgsraten oder Änderungen an den Daten gesammelt. Zusätzlich liefert die laparoskopische mln / Leber Sammeltechnik mit anderen Verfahren wie Sammlung von peripheren LNs, endoskopische oberen und unteren GI-Biopsien, Knochenmarksaspiration, Zerebrospinalflüssigkeit Sammlung und Venenpunktur bei derselben Anästhetikum Ereignis Berücksichtigung umfassende Auswertung erfolgreich kombiniert wurde virologischen und immunologischen Reaktionen auf serielle Weise (nicht veröffentlichte Daten).Das gesamte Verfahren dauert in der Regel 30 – 45 min zur Vervollständigung und wird durch zwei ~ 0,5 cm Einschnitte erreicht. Bei fettleibigen Tieren kann es notwendig sein, einen größeren Einschnitt zu machen (~ 1 bis 1,5 cm) MLN durch abrufen und zusätzliche Zeit erfordert können. Tiere mit umfangreichem mesenterialen Fett erfordern oft erhebliche Erfahrung auf differentiate MLN aus dem umgebenden Fett. MLN werden oft entlang der mesenterialen Gefäße und zu sein scheinen häufiger in der Nähe von Verzweigungspunkten in den Gefäßen gefunden. Ein kritischer Aspekt dieses Verfahrens ist, dass es die ausgewählte MLN erfordert eine ausreichende Mobilität im Mesenterium zu haben exteriorisiert Inzision durch die Bauch wird. Als Ergebnis kann diese Technik nicht zu sammeln MLN der Nähe der Wurzel des Mesenteriums verwendet werden. Aufgrund Vergrößerung ist es manchmal einfacher, MLN mit der Kamera zu identifizieren, und mit der Lokalisierung und Identifizierung des Knotens kann auf die MLN in enger Nähe zu erfassen helfen, sobald es exteriorisiert wird.
Die Nutzung der Trendelenburg-Position nicht immer für MLN Sammlung erforderlich sein, und wenn MLN leicht ohne die Verwendung von Trendelenburg-Position abgerufen werden können Leberbiopsien leichter machen, wie es die Organe verschieben kranial zu verhindern. Manchmal nach der Platzierung in Trendelenburg-Position wird die Leber nach oben verschoben gegen die Membran und Most werden vorsichtig wieder in Position vor der Biopsie Sammlung manipuliert. Da die Torplatzierung für die Sammlung MLN nach links, so werden Leberbiopsien typischerweise von den linken lateralen und medialen linken Leberlappen genommen, da sie näher an die Kanüle sind.
Gesammelte MLN und Leberbiopsien für eine Vielzahl von Downstream-Analysen reichlich Zellausbeuten zur Verfügung gestellt und zeigten eine hohe Lebensfähigkeit der gesammelten Zellen. Hier wurden die Zellen für die durchflusszytometrische Analyse von Leukozyten und Lymphozyten-Populationen gefärbt, und die wichtigsten Unterschiede zwischen diesen beiden wichtigen Immunorgane wurden aufgeklärt. Zum Beispiel wurden die MLN hoch angereicherte für CD4 + T – Zellen im Vergleich zur Leber, um die Bedeutung der MLN als Mittelpunkte für die Erfassung aufgrund und adaptive Immunantworten zu verbreiten, sowie die Bedeutung von CD4 + T für die Verwaltung von inflammatorischen und tolerogen Reaktionen auf das Milieu von Nahrungsaufnahme und GI-residente Mikroorganismen abgeleitete Antigenes = "xref"> 24. Jedoch wurde die Leber deutlich angereichert für CD14 + Leukozyten im Vergleich zu dem MLN. CD14 exprimiert überwiegend auf Monozyten und Makrophagen , und ist eine Schlüsselkomponente des Rezeptorkomplexes für bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) 25. Tatsächlich erhöhten Plasmakonzentrationen von löslichem CD14 sind mit mikrobiellem Translokation und Aktivierung des Immunsystems bei HIV und pathogenen SIV – Infektionen 26 verbunden. Somit höhere Frequenzen von CD14 + Leukozyten in der Leber wahrscheinlich aus einer größeren Bakterienbelastung in diesem Organe führen , wenn an den MLN verglichen.
Hier zeigen wir eine schnelle und minimal-invasive Operationstechnik zur Serien Sammlung von MLN und Leberbiopsien nur zwei kleine Schnitte für die laparoskopische Eintrag verwenden, die nicht auf irgendwelche negativen Ergebnissen geführt hat. Diese Proben stellen einen nützlichen Weg Schlüssel immunologische, virologische und mikrobiologische Prozesse zu bewerten, die pla nehmence in MLN und Leber, die aus systemischer Immunität getrennten und eindeutig sind. Ebenso sind kritische Leberbiopsien für die langfristige Bewertung der Auswirkungen von HIV / SIV, Drogentherapien und transloziert Mikroben, die oft erhebliche Leberschäden 16 induzieren kombinieren. Da ferner die MLN und Leber Immunorgane GI Mikrobiota ausgesetzt sind, die Fähigkeit, die Immunität in diesen Organen über die Zeit spielt die Rolle eine hervorragende Plattform bietet bewerten für das Verständnis, dass die microbiome Wirt Immunhomöostase aufrechtzuerhalten. Zusammengenommen Bewertung der Leber und MLN ist von großer Bedeutung im Zusammenhang mit der Vakzine und therapeutischer Wirksamkeiten, SIV viralen Clearance Reservoir und allgemeiner Schleimhaut-Immunität. Die Fähigkeit, diese Proben durch einen minimal-invasiven Ansatz zu sammeln bedeutet, dass es weniger Risiko einer Entzündung Zusammenhang mit dem Verfahren als mit dem derzeit veröffentlichten Techniken besteht und weniger Auswirkungen auf die Physiologie der Tiere. Im future, werden wir das Potenzial, zu kombinieren, um die Sammlung von MLN und Leber mit der Sammlung von Milz durch die gleichen zwei Hafenstandorte bewerten für die Probenahme von anderen wichtigen und deutlichen Teil des Immunsystems zu ermöglichen, die eine wichtige Rolle zu spielen hat sich gezeigt, in eine Reihe von Krankheitsmodellen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch die NIH Grant-Nummer P51OD010425 unterstützt.
Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
Hospira Lactated Ringer's 250 ml | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
Multipurpose Rigid Scope, 2.7mm x 187.5mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
Exam and Protective Sheath for 2.7mm x 187.5mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
Rigid scope, 5mm x 300mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
Veress Needle, 2mm x 80mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
Solid Probe with Markings, 5mm x 320mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5mm x 240mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
Biopsy Forceps, 3.5mm X 310mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5mm x 60mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
CO2 | Airgas | CD USPE | |
RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
5mL Syringe | BD | 309646 | |
50mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
5mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
LSR II Flow Cytometer | BD | NA |