Visualização de interação proteína-proteína em Citoplasmáticas frações nucleares e por co-imunoprecipitação e<em> In Situ</em> Proximidade Ligadura Assay
Summary
Protein-protein interactions can occur in both the nucleus and the cytoplasm of a cell. To investigate these interactions, traditional co-immunoprecipitation and modern proximity ligation assay are applied. In this study, we compare these two methods to visualize the distribution of NF90-RBM3 interactions in the nucleus and the cytoplasm.
Abstract
Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation is a popular technique to detect protein-protein interactions. Subsequent Western blot analysis is the most common method to visualize co-immunoprecipitated proteins. Recently, the proximity ligation assay has become a powerful tool to visualize protein-protein interactions in situ and provides the possibility to quantify protein-protein interactions by this method. Similar to conventional immunocytochemistry, the proximity ligation assay technique is also based on the accessibility of primary antibodies to the antigens, but in contrast, proximity ligation assay detects protein-protein interactions with a unique technique involving rolling-circle PCR, while conventional immunocytochemistry only shows co-localization of proteins.
Nuclear factor 90 (NF90) and RNA-binding motif protein 3 (RBM3) have been previously demonstrated as interacting partners. They are predominantly localized in the nucleus, but also migrate into the cytoplasm and regulate signaling pathways in the cytoplasmic compartment. Here, we compared NF90-RBM3 interaction in both the nucleus and the cytoplasm by co-immunoprecipitation and proximity ligation assay. In addition, we discussed the advantages and limitations of these two techniques in visualizing protein-protein interactions in respect to spatial distribution and the properties of protein-protein interactions.
Introduction
Fator nuclear 90 (NF90) é uma proteína multi-isoforma com inúmeras funções, incluindo a resposta à infecção viral, a regulação de interleucina-2 pós-transcrição e regulação do miRNA biogênese 1-3. RBM3 é uma proteína de ligação a ARN, envolvidos na tradução e miARN biogénese e pode ser induzida por vários factores de stress incluindo a hipoxia e hipotermia 4-6. Recentemente, encontramos NF90 e RBM3 em um complexo de proteínas 7. A interacção de NF90 e RBM3 é essencial para modular a actividade de proteína quinase-ARN como retículo endoplasmático quinase (PERK) em resposta proteína desdobrada 7. Ambos NF90 e RBM3 estão localizados predominantemente no núcleo, mas uma pequena proporção de NF90 e de transporte RBM3 para o citoplasma e se ligam uns aos outros para lá para funções específicas, por exemplo, para regular a actividade de vantagem. Portanto, é importante para visualizar a distribuição de interacções NF90-RBM3 no compartimento subcelular, que pode indicarseus vários papéis no respectivo compartimento.
Décadas atrás, dois híbridos de levedura (Y2H) foi desenvolvido para detectar a interacção entre duas proteínas 8. No entanto, devido à construção artificial de proteínas fundidas, falsos resultados positivos têm restringido a aplicação deste método. Durante muito tempo, a co-imunoprecipitação foi a principal técnica para analisar interacções proteína-proteína, especialmente em condições endógenas 9. Para analisar o complexo de proteína de co-imunoprecipitada, Western blot é a técnica mais conveniente, enquanto a espectrometria de massa é usada quando super-sensibilidade e precisão são desejados. Nos últimos anos, ensaio de proximidade de ligação foi desenvolvida como um método novo para a detecção de interacções proteína-proteína em ambas as células e tecidos in situ 10,11.
Aqui, nós comparamos o método de co-imunoprecipitação mais popular e método de ensaio de proximidade de ligação relativamente nova na captura NF9interacção 0-RBM3 em fracções subcelulares. Também discutimos as vantagens e limitações de ambas as técnicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Há vários benefícios, bem como deficiências para ambos os métodos. Como uma técnica relativamente nova, uma vantagem óbvia de ensaio de proximidade de ligação é a viabilidade para elucidar as interacções proteína-proteína ao nível de uma única célula em vez de um lote de células heterogéneas. Imagens com alta magnitude e resolução (por exemplo, através de microscópio confocal) prever a possibilidade de quantificação contando manchas fluorescentes individuais. Em contraste, a combinaçã…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Swiss National Science Foundation (SNSF, 31003A_163305).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D6429 | High glucose 4500 mg/L |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) antibody | BD Transduction Laboratories | 612154 | use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| RBM3 antibody | ProteinTech | 14363-1-AP | use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| Lamin A/C antibody | Cell Signaling Technology | #2032 | use 1:1000 for WB |
| anti-GAPDH antibody | Abcam | ab8245 | use 1:1000 for WB |
| normal rabbit IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| anti-rabbit IgG, HRP-lined secodary antiboy | Cell Signaling Technology | #7074 | use 1:5000 for WB |
| anti-mouse HRP secondary antibody | Carl Roth | 4759.1 | use 1:5000 for WB |
| Clarity Western ECL Blotting Substrate | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | CarlRoth | 6908.1 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Super RX X-ray film | Fujifilm | 4741029230 | |
| Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Normal goat serum (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA probe Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Detection Reagents Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink Wash Buffers Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Duolink Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| Microscope | Olympus | AX-70 | |
| CCD camera | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X-ray film | Fujifilm | Super RX | |
| Film processing machine | Fujifilm | FPM-100A |
Referencias
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