La visualización de la interacción proteína-proteína en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de Co-inmunoprecipitación y<em> In Situ</em> Ligadura ensayo de proximidad
Summary
Protein-protein interactions can occur in both the nucleus and the cytoplasm of a cell. To investigate these interactions, traditional co-immunoprecipitation and modern proximity ligation assay are applied. In this study, we compare these two methods to visualize the distribution of NF90-RBM3 interactions in the nucleus and the cytoplasm.
Abstract
Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation is a popular technique to detect protein-protein interactions. Subsequent Western blot analysis is the most common method to visualize co-immunoprecipitated proteins. Recently, the proximity ligation assay has become a powerful tool to visualize protein-protein interactions in situ and provides the possibility to quantify protein-protein interactions by this method. Similar to conventional immunocytochemistry, the proximity ligation assay technique is also based on the accessibility of primary antibodies to the antigens, but in contrast, proximity ligation assay detects protein-protein interactions with a unique technique involving rolling-circle PCR, while conventional immunocytochemistry only shows co-localization of proteins.
Nuclear factor 90 (NF90) and RNA-binding motif protein 3 (RBM3) have been previously demonstrated as interacting partners. They are predominantly localized in the nucleus, but also migrate into the cytoplasm and regulate signaling pathways in the cytoplasmic compartment. Here, we compared NF90-RBM3 interaction in both the nucleus and the cytoplasm by co-immunoprecipitation and proximity ligation assay. In addition, we discussed the advantages and limitations of these two techniques in visualizing protein-protein interactions in respect to spatial distribution and the properties of protein-protein interactions.
Introduction
Factor nuclear 90 (NF90) es una proteína multi-isoforma con numerosas funciones, incluyendo la respuesta a la infección viral, la regulación de la interleucina-2 post-transcripción y la regulación de los genes miARN la biogénesis 1-3. RBM3 es una proteína de unión al ARN, implicados en la traducción y miARN biogénesis y puede ser inducida por varios factores estresantes incluyendo hipotermia y la hipoxia 4-6. Recientemente, hemos encontrado NF90 y RBM3 en un complejo de proteínas 7. La interacción de NF90 y RBM3 es esencial para modular la actividad de la proteína quinasa ARN-como retículo endoplásmico quinasa (PERK) en respuesta a proteínas desplegadas 7. Tanto NF90 y RBM3 se encuentran predominantemente en el núcleo, pero una pequeña proporción de NF90 y la lanzadera RBM3 en el citoplasma y se unen allí entre sí para funciones específicas, por ejemplo para regular la actividad PERK. Por lo tanto, es importante para visualizar la distribución de las interacciones NF90-RBM3 en el compartimiento subcelular, lo que puede indicarsus diversos papeles en el compartimento respectivo.
Hace décadas, los dos híbridos de levadura (Y2H) fue desarrollado para detectar la interacción entre dos proteínas 8. Sin embargo, debido a la construcción artificial de proteínas fusionadas, resultados falsos positivos han restringido la aplicación de este método. Durante mucho tiempo, co-inmunoprecipitación fue la principal técnica para analizar interacciones proteína-proteína, especialmente en condiciones endógenas 9. Para analizar el complejo de proteínas co-inmunoprecipitó, Western blot es la técnica más conveniente, mientras que la espectrometría de masas se utiliza cuando se desean súper sensibilidad y precisión. En los últimos años, el ensayo de ligamiento por proximidad ha sido desarrollado como un nuevo método para detectar interacciones proteína-proteína en ambas células y tejidos in situ 10,11.
A continuación, se comparó el método de co-inmunoprecipitación más popular y relativamente novedoso método de ensayo de ligamiento por proximidad en la captura de NF9interacción 0-RBM3 en fracciones subcelulares. También discutimos las ventajas y limitaciones de ambas técnicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios beneficios, así como las deficiencias de ambos métodos. Como una técnica relativamente nueva, una ventaja obvia de ensayo de ligamiento por proximidad es la viabilidad de dilucidar las interacciones proteína-proteína a nivel de una sola célula en lugar de un lote de células heterogéneas. Las imágenes con alta resolución y magnitud (por ejemplo, mediante microscopio confocal) proporcionan la posibilidad para la cuantificación contando puntos fluorescentes individuales. En contraste, la comb…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Swiss National Science Foundation (SNSF, 31003A_163305).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D6429 | High glucose 4500 mg/L |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) antibody | BD Transduction Laboratories | 612154 | use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| RBM3 antibody | ProteinTech | 14363-1-AP | use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| Lamin A/C antibody | Cell Signaling Technology | #2032 | use 1:1000 for WB |
| anti-GAPDH antibody | Abcam | ab8245 | use 1:1000 for WB |
| normal rabbit IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| anti-rabbit IgG, HRP-lined secodary antiboy | Cell Signaling Technology | #7074 | use 1:5000 for WB |
| anti-mouse HRP secondary antibody | Carl Roth | 4759.1 | use 1:5000 for WB |
| Clarity Western ECL Blotting Substrate | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | CarlRoth | 6908.1 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Super RX X-ray film | Fujifilm | 4741029230 | |
| Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Normal goat serum (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA probe Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Detection Reagents Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink Wash Buffers Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Duolink Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| Microscope | Olympus | AX-70 | |
| CCD camera | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X-ray film | Fujifilm | Super RX | |
| Film processing machine | Fujifilm | FPM-100A |
Referencias
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