Visualisation des interaction protéine-protéine en nucléaire et cytoplasmique Fractions par Co-immunoprécipitation et<em> In Situ</em> Proximité Ligation Assay
Summary
Protein-protein interactions can occur in both the nucleus and the cytoplasm of a cell. To investigate these interactions, traditional co-immunoprecipitation and modern proximity ligation assay are applied. In this study, we compare these two methods to visualize the distribution of NF90-RBM3 interactions in the nucleus and the cytoplasm.
Abstract
Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation is a popular technique to detect protein-protein interactions. Subsequent Western blot analysis is the most common method to visualize co-immunoprecipitated proteins. Recently, the proximity ligation assay has become a powerful tool to visualize protein-protein interactions in situ and provides the possibility to quantify protein-protein interactions by this method. Similar to conventional immunocytochemistry, the proximity ligation assay technique is also based on the accessibility of primary antibodies to the antigens, but in contrast, proximity ligation assay detects protein-protein interactions with a unique technique involving rolling-circle PCR, while conventional immunocytochemistry only shows co-localization of proteins.
Nuclear factor 90 (NF90) and RNA-binding motif protein 3 (RBM3) have been previously demonstrated as interacting partners. They are predominantly localized in the nucleus, but also migrate into the cytoplasm and regulate signaling pathways in the cytoplasmic compartment. Here, we compared NF90-RBM3 interaction in both the nucleus and the cytoplasm by co-immunoprecipitation and proximity ligation assay. In addition, we discussed the advantages and limitations of these two techniques in visualizing protein-protein interactions in respect to spatial distribution and the properties of protein-protein interactions.
Introduction
Facteur nucléaire 90 (NF90) est une protéine multi-isoforme avec de nombreuses fonctions , y compris la réponse à l' infection virale, la régulation de l' interleukine-2 post-transcription et la régulation de la biogenèse des miARN 1-3. RBM3 est une protéine de liaison à l' ARN, impliqués dans la traduction et la biogenèse des miARN et peut être induite par divers facteurs de stress , y compris l' hypothermie et l' hypoxie 4-6. Récemment, nous avons trouvé NF90 et RBM3 dans un complexe protéique 7. L'interaction de NF90 et RBM3 est essentiel pour moduler la protéine kinase réticulum endoplasmique kinase (PERK) l' activité de l' ARN comme en réponse de la protéine dépliée 7. Deux NF90 et RBM3 sont situés principalement dans le noyau , mais une faible proportion de NF90 et une navette RBM3 dans le cytoplasme et il se lient les unes aux autres pour des fonctions spécifiques, par exemple pour réguler l' activité PERK. Par conséquent, il est important de visualiser la répartition des interactions NF90-RBM3 dans le compartiment sous-cellulaire, ce qui peut indiquerleurs différents rôles dans le compartiment respectif.
Il y a des décennies, deux hybrides de levure (Y2H) a été développé pour détecter l'interaction entre les deux protéines 8. Cependant, en raison de la construction artificielle de protéines fusionnées, des résultats faussement positifs ont restreint l'application de cette méthode. Pendant longtemps, la co-immunoprécipitation a été la principale technique pour analyser les interactions protéine-protéine, en particulier dans des conditions endogènes 9. D'analyser le complexe protéique de co-immunoprécipitation, Western Blot est la technique la plus commode, tandis que la spectrométrie de masse est utilisée lorsque super-sensibilité et la précision sont souhaitées. Au cours des dernières années, un essai de ligature de proximité a été développé comme un nouveau procédé pour détecter des interactions protéine-protéine dans les cellules et les tissus in situ 10,11.
Ici, nous avons comparé la méthode de co-immunoprécipitation le plus populaire et relativement nouvelle méthode d'essai de ligature de proximité dans la capture NF9l'interaction 0-RBM3 dans les fractions subcellulaires. Nous avons également discuté les avantages et les limites des deux techniques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a plusieurs avantages ainsi que des lacunes pour les deux méthodes. En tant que technique relativement nouvelle, un avantage évident d'essai de ligature de proximité est la possibilité d'élucider les interactions protéine-protéine au niveau d'une seule cellule au lieu d'un lot de cellules hétérogènes. Images à haute intensité et de la résolution (par exemple par microscope confocal) offrent la possibilité pour la quantification par comptage des taches fluorescentes simples. En…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Swiss National Science Foundation (SNSF, 31003A_163305).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D6429 | High glucose 4500 mg/L |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) antibody | BD Transduction Laboratories | 612154 | use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| RBM3 antibody | ProteinTech | 14363-1-AP | use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| Lamin A/C antibody | Cell Signaling Technology | #2032 | use 1:1000 for WB |
| anti-GAPDH antibody | Abcam | ab8245 | use 1:1000 for WB |
| normal rabbit IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| anti-rabbit IgG, HRP-lined secodary antiboy | Cell Signaling Technology | #7074 | use 1:5000 for WB |
| anti-mouse HRP secondary antibody | Carl Roth | 4759.1 | use 1:5000 for WB |
| Clarity Western ECL Blotting Substrate | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | CarlRoth | 6908.1 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Super RX X-ray film | Fujifilm | 4741029230 | |
| Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Normal goat serum (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA probe Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Detection Reagents Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink Wash Buffers Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Duolink Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| Microscope | Olympus | AX-70 | |
| CCD camera | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X-ray film | Fujifilm | Super RX | |
| Film processing machine | Fujifilm | FPM-100A |
Referencias
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