Summary

Visualisering av protein-proteininteraktion i nukleära och cytoplasmiska fraktioner av Co-immunoprecipitation och<em> In Situ</em> Proximity Ligation Assay

Published: January 16, 2017
doi:

Summary

Protein-protein interactions can occur in both the nucleus and the cytoplasm of a cell. To investigate these interactions, traditional co-immunoprecipitation and modern proximity ligation assay are applied. In this study, we compare these two methods to visualize the distribution of NF90-RBM3 interactions in the nucleus and the cytoplasm.

Abstract

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation is a popular technique to detect protein-protein interactions. Subsequent Western blot analysis is the most common method to visualize co-immunoprecipitated proteins. Recently, the proximity ligation assay has become a powerful tool to visualize protein-protein interactions in situ and provides the possibility to quantify protein-protein interactions by this method. Similar to conventional immunocytochemistry, the proximity ligation assay technique is also based on the accessibility of primary antibodies to the antigens, but in contrast, proximity ligation assay detects protein-protein interactions with a unique technique involving rolling-circle PCR, while conventional immunocytochemistry only shows co-localization of proteins.

Nuclear factor 90 (NF90) and RNA-binding motif protein 3 (RBM3) have been previously demonstrated as interacting partners. They are predominantly localized in the nucleus, but also migrate into the cytoplasm and regulate signaling pathways in the cytoplasmic compartment. Here, we compared NF90-RBM3 interaction in both the nucleus and the cytoplasm by co-immunoprecipitation and proximity ligation assay. In addition, we discussed the advantages and limitations of these two techniques in visualizing protein-protein interactions in respect to spatial distribution and the properties of protein-protein interactions.

Introduction

Nukleär faktor 90 (NF90) är en multi-isoform protein med många funktioner, inklusive svar på virusinfektion, reglering av interleukin-2 efter transkription och reglering av miRNA biogenes 1-3. RBM3 är ett RNA-bindande protein, involverat i översättning och miRNA biogenes och kan induceras av olika stress inklusive hypotermi och hypoxi 4-6. Nyligen fann vi NF90 och RBM3 i ett proteinkomplex 7. Interaktionen mellan NF90 och RBM3 är viktigt att modulera proteinkinas RNA liknande endoplasmatiska retiklet kinas (PERK) aktivitet i ovikt protein svar 7. Både NF90 och RBM3 ligger främst i kärnan men en liten del av NF90 och RBM3 shuttle in i cytoplasman och binda det till varandra för specifika funktioner, till exempel för att reglera PERK aktivitet. Därför är det viktigt att visualisera fördelningen av NF90-RBM3 interaktioner i subcellulär avdelning, vilket kan tyda påderas olika roller i respektive fack.

Decennier sedan, jäst två hybrid (Y2H) utvecklats för att detektera växelverkan mellan två proteiner 8. Emellertid, på grund av artificiell konstruktion av sammansmälta proteiner, har falska positiva resultat begränsat tillämpningen av denna metod. Under en lång tid, co-immunoprecipitation var huvud teknik för att analysera protein-proteininteraktioner, särskilt i endogena förhållanden 9. För att analysera sam-immunoprecipiterade proteinkomplexet, är Western blot den lämpligaste tekniken, medan masspektrometri används när super känslighet och noggrannhet önskas. Under de senaste åren har närhet ligering analys utvecklats som en ny metod för att detektera protein-proteininteraktioner i både celler och vävnader in situ 10,11.

Här, vi jämförde mest populära co-immunoprecipitation metod och relativt ny närhet ligering analysmetod fånga NF90-RBM3 interaktion i subcellulära fraktioner. Vi diskuterade också de fördelar och begränsningar av båda teknikerna.

Protocol

1. Co-immunoprecipitation Frö HEK293 celler vid 2 x 10 5 celler per brunn i en 6-brunnars platta i 2 ml Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) komplettera med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 100 U / ml penicillin-streptomycin (Pen-Strep) . Odla cellerna under 48 h vid 37 ° C med 5% CO2. Tvätta cellerna med kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tre gånger. Harvest cellerna genom centrifugering vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C. Förbered nukleära o…

Representative Results

Figur 1 visar att NF90 och RBM3 är båda kärnproteiner och endast en liten fraktion är närvarande i cytoplasman. Noterbart är att det finns tre olika band färgade positivt för RBM3. Den minsta strax under 20 kDa visar rätt storlek på RBM3 (den förutsagda molekylvikt RBM3 är 17 kDa). Ursprunget för de två andra band återstår att undersöka. Co-immunoprecipitation experiment med RBM3 som betesproteinet avslöjade att NF90-RBM3 interaktioner är övervägande…

Discussion

Det finns flera fördelar liksom brister för båda metoderna. Som en relativt ny teknik, är en uppenbar fördel av närheten ligation assay möjligheten att belysa protein-proteininteraktioner vid encelliga nivå i stället för en sats av heterogena celler. Bilder med hög magnitud och upplösning (t.ex. genom konfokalmikroskop) ger möjlighet för kvantifiering genom att räkna enskilda fluorescerande fläckar. I motsats härtill den konventionella kombinationen av co-immunoprecipitation tekniken med Wester…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was supported by the Swiss National Science Foundation (SNSF, 31003A_163305).

Materials

Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) Sigma D6429 High glucose
4500 mg/L
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific 10270106
Penicillin-Streptomycin (PenStrep) BioConcept 4-01F00-H
NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents Thermo Fisher Scientific 78833
1,4-Dithiothreitol (DTT) Carl Roth 6908.3
Dynabeads Protein G Novex, Thermo Fisher Scientific 10003D
DRBP76 (NF90/NF110) antibody BD Transduction Laboratories 612154 use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA
RBM3 antibody ProteinTech 14363-1-AP use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA
Lamin A/C antibody Cell Signaling Technology #2032 use 1:1000 for WB 
anti-GAPDH antibody Abcam ab8245 use 1:1000 for WB 
normal rabbit IgG Santa Cruz sc-2027
anti-rabbit IgG, HRP-lined secodary antiboy Cell Signaling Technology #7074 use 1:5000 for WB 
anti-mouse HRP secondary antibody Carl Roth 4759.1 use 1:5000 for WB 
Clarity Western ECL Blotting Substrate Bio-Rad #1705060
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel Novex, Thermo Fisher Scientific NP0321BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Novex, Thermo Fisher Scientific NP0007
1,4-Dithiothreitol (DTT) CarlRoth 6908.1
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) Novex, Thermo Fisher Scientific NP0002
NuPAGE Transfer Buffer (20x) Novex, Thermo Fisher Scientific NP00061
Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane GE Healthcare Life Sciences 10600021
Super RX X-ray film Fujifilm 4741029230
Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide Corning BioCoat 354632
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148
Normal goat serum (NGS) Gibco, Thermo Fisher Scientific PCN5000
Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific A-11001
Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate Thermo Fisher Scientific A-11011
4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) Sigma D9542
Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS Sigma DUO92001
Duolink PLA  probe Anti-rabbit MINUS Sigma DUO92005
Duolink Detection Reagents Red Sigma DUO92008
Duolink Wash Buffers Fluorescence Sigma DUO82049
Duolink Mounting Medium with DAPI Sigma DUO82040
Mowiol 4-88 Sigma 81381
Microscope Olympus AX-70
CCD camera SPOT Insight 2MP Firewire
X-ray film Fujifilm Super RX
Film processing machine Fujifilm FPM-100A

Referencias

  1. Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication?. Biochimie. 108, 20-24 (2015).
  2. Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
  3. Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
  4. Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
  5. Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
  6. Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
  7. Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
  8. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  9. Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
  10. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
  11. Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
  12. Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).

Play Video

Citar este artículo
Zhu, X., Zelmer, A., Wellmann, S. Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (119), e55218, doi:10.3791/55218 (2017).

View Video