Summary

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및<em> 현장에서</em> 근접 내고 분석

Published: January 16, 2017
doi:

Summary

Protein-protein interactions can occur in both the nucleus and the cytoplasm of a cell. To investigate these interactions, traditional co-immunoprecipitation and modern proximity ligation assay are applied. In this study, we compare these two methods to visualize the distribution of NF90-RBM3 interactions in the nucleus and the cytoplasm.

Abstract

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation is a popular technique to detect protein-protein interactions. Subsequent Western blot analysis is the most common method to visualize co-immunoprecipitated proteins. Recently, the proximity ligation assay has become a powerful tool to visualize protein-protein interactions in situ and provides the possibility to quantify protein-protein interactions by this method. Similar to conventional immunocytochemistry, the proximity ligation assay technique is also based on the accessibility of primary antibodies to the antigens, but in contrast, proximity ligation assay detects protein-protein interactions with a unique technique involving rolling-circle PCR, while conventional immunocytochemistry only shows co-localization of proteins.

Nuclear factor 90 (NF90) and RNA-binding motif protein 3 (RBM3) have been previously demonstrated as interacting partners. They are predominantly localized in the nucleus, but also migrate into the cytoplasm and regulate signaling pathways in the cytoplasmic compartment. Here, we compared NF90-RBM3 interaction in both the nucleus and the cytoplasm by co-immunoprecipitation and proximity ligation assay. In addition, we discussed the advantages and limitations of these two techniques in visualizing protein-protein interactions in respect to spatial distribution and the properties of protein-protein interactions.

Introduction

핵 인자 90 (NF90)은 인터루킨 -2 후 전사 및 miRNA의 생합성 1-3의 규제의 바이러스 감염에 대한 반응 조절 등 다양한 기능을 가진 멀티 이소 단백질이다. RBM3는 RNA 결합 단백질 번역 및 miRNA의 생합성에 관여 저체온증 저산소증 4-6을 포함하는 다양한 스트레스에 의해 유도 될 수있다. 최근에, 우리는 단백질 복합체 7 NF90 및 RBM3를 발견했다. NF90 RBM3과의 상호 작용은 단백질 펼친 응답 7 단백질 키나제 RNA 같은 소포체 키나제 (PERK) 활성을 조절하는 것이 필수적이다. NF90 및 RBM3 모두 핵하지만 세포질에 작은 NF90의 비율과 RBM3 셔틀에 주로 위치하며, PERK 활동을 조절하는 특정 기능을 위해 서로가 예를 결합한다. 따라서, 어느 것을 나타낼 수 있고, 세포 내 구획에서-NF90 RBM3 상호 작용의 분포를 시각화하는 것이 중요각각의 구획에서의 다양한 역할.

수십 년 전에, 효모 두 하이브리드 (Y2H)는 두 단백질 (8) 사이의 상호 작용을 검출하기 위해 개발되었다. 그러나, 융합 단백질의 인공 건설, 거짓 양성 결과는이 방법의 적용을 제한하고있다. 오랫동안, 공동 면역 침전 특히 내인성 조건 9, 단백질 – 단백질 상호 작용을 분석하는 주요 기술이다. 최고 감도 및 정밀도가 요구되는 경우, 질량 스펙트럼에서 사용되는 동안에 공동 면역 침전 된 단백질 복합체를 분석, 웨스턴 블롯, 가장 편리한 기술이다. 최근, 근접 결찰 분석은 동일계 10,11 모두에서 세포 및 조직에서의 단백질 – 단백질 상호 작용을 검출하는 신규 한 방법으로 개발되었다.

여기서는 NF9 캡처에서 가장 인기있는 공동 면역 침전 법 및 비교적 신규 근접 결찰 분석 방법에 비해세포 내 분수에 0 RBM3 상호 작용. 우리는 또한 장점과 두 가지 기술의 한계를 논의했다.

Protocol

1. 공동 면역 침전 씨앗 하나 6 웰 플레이트에 웰 당 2 × 10 5 세포에서 HEK293 세포 2 ㎖의 10 % 소 태아 혈청 (FBS)와 함께 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM) 보충 100 U / mL의 페니실린 – 스트렙토 마이신 (펜 연쇄상 구균) . 5 % CO 2, 37 ℃에서 48 시간 동안 세포를 성장. 차가운 인산 완충 식염수 (PBS)로 3 회 세포를 씻으십시오. 4 ° C에서 5 분 500 XG에 원심 분리하여 수확 …

Representative Results

도 1 및 NF90 RBM3 모두 핵 단백질과 작은 부분이 세포질에 존재하는 것을 보여준다. 특히, RBM3에 대한 긍정적 인 스테인드 세 가지 밴드가 있습니다. 20 kDa의 아래 작은이 RBM3의 정확한 크기를 반영 (RBM3의 예측 분자량이 17 kDa의)입니다. 다른 두 밴드의 기원은 조사가 남아있다. 미끼 단백질로 RBM3와 공동 면역 침전 실험 NF90-RBM3 상호 작용은 핵 및 세포질에서 소수 ?…

Discussion

두 방법에 대한 몇 가지 장점뿐만 아니라 단점이있다. 비교적 새로운 기술로서, 인접 결찰 분석법의 명백한 이점은 단일 세포 수준 대신 이기종 셀 배치의 단백질 – 단백질 상호 작용을 규명 할 수있는 가능성이다. 높은 크기 및 (공 초점 현미경으로 예) 해상도의 이미지는 하나의 형광 반점을 계산하여 정량화에 대한 가능성을 제공합니다. 대조적으로, 웨스턴 블랏과 공동 면역 침전 기술의…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was supported by the Swiss National Science Foundation (SNSF, 31003A_163305).

Materials

Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) Sigma D6429 High glucose
4500 mg/L
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific 10270106
Penicillin-Streptomycin (PenStrep) BioConcept 4-01F00-H
NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents Thermo Fisher Scientific 78833
1,4-Dithiothreitol (DTT) Carl Roth 6908.3
Dynabeads Protein G Novex, Thermo Fisher Scientific 10003D
DRBP76 (NF90/NF110) antibody BD Transduction Laboratories 612154 use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA
RBM3 antibody ProteinTech 14363-1-AP use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA
Lamin A/C antibody Cell Signaling Technology #2032 use 1:1000 for WB 
anti-GAPDH antibody Abcam ab8245 use 1:1000 for WB 
normal rabbit IgG Santa Cruz sc-2027
anti-rabbit IgG, HRP-lined secodary antiboy Cell Signaling Technology #7074 use 1:5000 for WB 
anti-mouse HRP secondary antibody Carl Roth 4759.1 use 1:5000 for WB 
Clarity Western ECL Blotting Substrate Bio-Rad #1705060
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel Novex, Thermo Fisher Scientific NP0321BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Novex, Thermo Fisher Scientific NP0007
1,4-Dithiothreitol (DTT) CarlRoth 6908.1
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) Novex, Thermo Fisher Scientific NP0002
NuPAGE Transfer Buffer (20x) Novex, Thermo Fisher Scientific NP00061
Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane GE Healthcare Life Sciences 10600021
Super RX X-ray film Fujifilm 4741029230
Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide Corning BioCoat 354632
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148
Normal goat serum (NGS) Gibco, Thermo Fisher Scientific PCN5000
Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific A-11001
Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate Thermo Fisher Scientific A-11011
4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) Sigma D9542
Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS Sigma DUO92001
Duolink PLA  probe Anti-rabbit MINUS Sigma DUO92005
Duolink Detection Reagents Red Sigma DUO92008
Duolink Wash Buffers Fluorescence Sigma DUO82049
Duolink Mounting Medium with DAPI Sigma DUO82040
Mowiol 4-88 Sigma 81381
Microscope Olympus AX-70
CCD camera SPOT Insight 2MP Firewire
X-ray film Fujifilm Super RX
Film processing machine Fujifilm FPM-100A

Referencias

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Zhu, X., Zelmer, A., Wellmann, S. Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (119), e55218, doi:10.3791/55218 (2017).

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