Summary

Эффективная и высокая Метод Выход для выделения мышиных дендритных клеток подмножествах

Published: April 18, 2016
doi:

Summary

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Abstract

Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антиген-представляющих клеток, прежде всего, ответственные за сбора, обработки и представления антигенов на антиген-представляющих молекул для инициирования Т-клеточного иммунитета. Дендритные клетки могут быть разделены на несколько фенотипически и функционально разнородных подмножеств. Три важных подмножества селезеночных дендритных клеток плазмоцитов, CD8α Pos и CD8α Neg клетки. В плазмоцитов бездисковые натуральные производители типа интерферона и имеют важное значение для противовирусного Т-клеточного иммунитета. Подмножество CD8α отр DC специализирован для MHC класса II презентации антигена и центрально участвует в грунтования CD4 Т – клеток. CD8α Pos контроллеры домена в первую очередь ответственны за кросс-презентации экзогенных антигенов и клеток грунтования CD8 Т. В CD8α Pos РС были продемонстрированы наиболее эффективным на презентации антигенов гликолипидов молекулами CD1d специализированному Т CELл население известный как инвариант естественных киллеров Т (iNKT) клеток. Введение Flt-3 лиганд увеличивает частоту миграции дендритных клеток-предшественников клеток из костного мозга, в конечном счете, приводит к расширению дендритных клеток в периферических лимфоидных органах в мышиных моделях. Мы адаптировали эту модель , чтобы очистить большое количество функциональных дендритных клеток для использования в экспериментах по передаче клеток для сравнения знания в естественных условиях различных подмножеств DC.

Introduction

Дендритные клетки (ДК) были обнаружены почти сорок лет назад как "большой звездчатые (греческий дендрон) клетка" находится в лимфоидных органах 1. Многие исследования показали , что контроллеры домена являются единственными антиген – представляющих клеток , которые могут эффективно стимулировать наивные Т – клетки 2. Основная функция этих клеток является поглощение и презентацию антигенов и их эффективную обработку и загрузку их на антиген-представляющих молекул. В селезенке мыши, контроллеры домена могут быть разделены на плазмоцитов и обычных подмножеств. В плазмоцитов ДК характеризуются низкой экспрессии CD11c и высоких уровней B220 и Gr-1. Они также являются позитивными для поверхностного маркера mPDCA1 и секретируют типа интерферона в ответ на Толл-подобные рецепторы 9 (TLR9) лигандов. Обычные контроллеры домена являются высокими для CD11c и экспрессии МНС класса II. Они могут быть разделены на три отдельные подмножества на основе поверхностной экспрессии фенотипических маркеров, таких как CD4, CD8α, DEC205, компакт-диск11b и дендритных клеток ингибирующий рецептор 2 (DCIR2, распознается антителом 33D1) белки 3,4. В CD8α Pos контроллеры домена также известны как cDC1, являются позитивными для DEC205, но отрицательный результат для миелоидных маркеров , таких как CD11b и 33D1. CD8α отр контроллеры домена, называемый также Cdc2, являются положительными для 33D1, CD11b и CD4 , но не имеют DEC205. Двойное отрицание подмножество (т.е. отрицательный как для CD4 и CD8α) относительно редко, и является негативной для DEC205 и 33D1. Это наименее отличающееся подмножество и может быть менее дифференцированными форма CD8α Neg DC.

Фенотипические различия в различных подмножеств DC также распространяются на их функции в естественных условиях. CD8α отр контроллеры домена обладают высокой фагоцитарной и , как полагают , чтобы представить экзогенный антиген в основном через МНС класса II к CD4 Т – клеток 3. В противоположность этому , CD8α Pos контроллеры домена специализированы для представления растворимого белкового антигена на MHC класса Iв механизме называется кросс-презентации. Результаты перекрестной презентации зависит от состояния активации этих контроллеров домена 5, и может привести либо к расширению цитотоксических Т – клеток (CTL) или развитие регуляторных Т – клеток , 6 2,7. Нацеливание антигена CD8α Pos ГЦ с использованием анти-DEC205-антителоопосредуемый результатами доставки в основном к удалению Т – клеток , 8, в то время как презентация антигенов , полученных из инфицированных апоптотических клеток индуцирует сильный CTL – ответ 9.

В дополнение к признанию пептидных антигенов, иммунной системы млекопитающих эволюционировала распознавать липидный и гликолипидов антигены. Эти антигены представлены молекулами CD1, которые являются MHC класса I, как белки клеточной поверхности, которые существуют в нескольких связанных форм в различных млекопитающих. У мышей, один тип высококонсервативной молекулы CD1 называется CD1d отвечает за представление гликолипида антигенов 10. Основным популяция Т-клеток, которые распознают CD1d / гликолипидов комплексы называют инвариантными клетки НКТ (iNKT клетки). Эти клетки экспрессируют полуинвариантом Т – клеточного рецептора (TCR) , состоящий из инвариантной TCRα цепи, которая в паре с TCR & beta ; цепи , которые имеют ограниченное разнообразие 11. В отличие от обычных Т – клеток , которые должны размножаться и дифференцироваться , чтобы стать активированные эффекторные Т – клетки, клетки iNKT существуют как эффекторной популяции и начинают быстро отвечать на запросы после введения гликолипидов 12. Идентификация физиологически соответствующих липидный антигенпрезентирующих клеток является активной областью исследований, а также несколько различных типов клеток, таких как В-клетки, макрофаги и ДК было предложено выполнить эту функцию. Тем не менее, было показано , что CD8α Pos подмножество ГЦ является первичной ячейкой опосредовать поглощение и представление липидных антигенов мыши iNKT клетки 13 и гликолипидов опосредованного перекрестного примирования CD8 Т – клеток 14.

ove_content "> Для сравнения эффективности презентации антигена с помощью различных антиген-представляющих клеток, простой подход состоит в передаче различных типов очищенных АРС импульсными с эквивалентными количествами антигена в наивных хозяев. Эксперименты клеточного переноса этого типа часто выполняются для иммунологических исследований. Тем не менее, проведение исследований переноса с экс виво антиген обработанного ГЦ является сложной задачей, так как эти клетки существуют как редкие популяции в лимфоидных органах , где они составляют менее 2% от общего количества клеток 15. поэтому необходимо усилить развитие этих клеток в животных – доноров для повышения эффективности протоколов изоляции.

Известно , что общий лимфоидной и миелоидной общие клетки – предшественники, которые необходимы для генерации Pdc, CD8 и Pos подмножеств CD8 отр DC, экспресс – FMS связанных с рецепторной тирозинкиназы 3 (Flt-3). При в естественных условиях Flt-3 лиганд (Flt-3L) введение, emigratион Flt-3 , экспрессирующих клеток – предшественников костного мозга увеличивается, что приводит к увеличению обсеменения периферических лимфоидных органах и расширение их зрелого потомстве DC 16. Выражение FLT-3 теряется во время приверженности B, T или NK путей дифференцировки клеток. Таким образом, лишь минимальные изменения наблюдаются в этих клетках при введении Flt-3L. Подобное расширение в популяциях постоянного тока наблюдается у мышей , несущих опухоли путем имплантации клеточной линии В16-меланома , секретирующих мышиный FLT-3L, который обеспечивает простой и экономичный способ обеспечения устойчивые системные уровни FLT-3L 17,18. Используя этот подход, мы разработали протокол, основанный на имплантации B16-клеток меланомы, секретирующих Flt-3L, чтобы стимулировать расширение всех нормальных подмножеств DC в селезенке мышей, тем самым значительно увеличивая урожаи этих клеток, которые могут быть выделены для последующих экспериментов , Мы последовательно находим, что в течение 10 – 14 дней после подкожного внутримышечноплантация опухоли, секретирующие Flt-3, мыши развивают спленомегалия с выраженным обогащением контроллеров домена составлять 40 – 60% от общего количества клеток селезенки. Из этих селезенке, различные подмножества DC могут быть выделены с высокой степенью чистоты с использованием стандартных коммерчески доступных наборов очистки клеток, которые используют подмножество специфических фенотипических маркеров.

Protocol

Эксперименты на животных проводятся в соответствии с утвержденными руководящими принципами от институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC). Все процедуры, требующие стерильности выполняются в кабинете биологической безопасности. 1. Имплантация …

Representative Results

Результатом этой процедуры зависит от расширения подмножеств DC мышиным Flt-3L, выраженной имплантированных клеток меланомы. Опухоль B16.Flt3L была получена из C57BL / 6 мышей, и должны быть имплантированы животным с этим штаммом фон для того, чтобы избежать выхода из строя опух?…

Discussion

Дендритные клетки принимаются быть основным профессиональным антигенпрезентирующая клеток, участвующих в грунтования Т-клеточных ответов. Их основная функция состоит в обследовании микросреду тканей путем принятия и обработки антигенов для презентации Т-клеткам. Для изучения функ?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана NIH / NIAID грант AI45889 к сокодвижение цитометрии исследования проводились с использованием основных объектов FACS при поддержке онкологического центра Эйнштейна (NIH / NCI CA013330) и Центра исследований СПИДа (NIH / NIAID AI51519).

Materials

0.05% Trypsin-EDTA  Life Technologies, Gibco 25300-054
Isoflurane  Sigma-Aldrich CDS019936-250MG
Collagenase D  Roche Diagnostics 11088858001
DNase I (dry powder) QIAGEN 79254
200 proof ethanol  Thermo Fisher Scientific 9-6705-004-220 Used to prepare 70% ethanol
RBC lysis buffer Sigma-Aldrich R7757
RPMI-1640 medium with L-glutamine  Life Technologies, Gibco 11875-119
DMEM medium with L-glutamine  Life Technologies, Gibco 11995-073
200 mM L-glutamine  Life Technologies 25030081
MEM non-essential amino acids  Life Technologies, Gibco 11140-050
MEM essential amino acids  Life Technologies 11130-051 
β-mercaptoethanol  Life Technologies, Invitrogen 21985-023
Sodium pyruvate  Life Technologies 11360-070
HEPES  Life Technologies, Invitrogen 15630
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) Life Technologies, Invitrogen 20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) Life Technologies, Gibco 14040-182
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution  Life Technologies 15575-020
Bovine serum albumin (BSA)  Sigma-Aldrich A2153
Fetal calf serum Atlanta Biologicals S11050 
Penicillin/streptomycin  Life Technologies, Invitrogen 15140-163
Trypan blue (dry powder)  Sigma-Aldrich T6146-5G  Prepare 0.08% with PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse Miltenyi Biotech 130-092-786
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c  Miltenyi Biotech 130-152-001
CD8αPos mouse DC isolation kit  Miltenyi Biotech 130-091-169
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) BD Biosciences 553141
Anti-mouse CD11c-FITC  BD Biosciences 553801
Anti-mouse CD8α-PerCP  BD Biosciences 553036
Anti-mouse B220-PE  BD Biosciences 553090
1 ml syringes  BD 26048
23 G1 needle  BD 305145
100 mm Petri dishes  Thermo Fisher Scientific 875712
Surgical instruments  Kent Scientific INSMOUSEKIT
Cell strainer (70 µm  BD 352350
Large Petri plates  Thermo Fisher Scientific FB0875712
Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um  Corning 431097
LS columns  Miltenyi 130-042-401
Magnetic stand MACS separator  Miltenyi Biotec 130-042-302
Wide-bore 200 μl pipette tips  PerkinElmer 111623
Corning ultra-low attachment 96-well plates  Corning CLS3474-24EA
6-8 week old female C57BL/6 mice  Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L melanoma cell line described by Mach et al. ,2000
Serum free DMEM and RPMI media
500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine

5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM)    

5 ml HEPES Buffer (1 M)    

5 ml L-glutamine (200 mM) 

0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need.  Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system.
Complete RPMI and DMEM media Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.
MACS buffer:  Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). 
FACS staining buffer Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution
Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000-
2,000 Units of collagenase activity per ml

This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use

Referencias

  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  3. Dudziak, D., et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 315 (5808), 107-111 (2007).
  4. Belz, G. T., Nutt, S. L. Transcriptional programming of the dendritic cell network. Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).
  5. den Haan, J. M., Bevan, M. J. Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo. J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).
  6. Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
  7. Yamazaki, S., et al. CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).
  8. Mukherjee, G., et al. DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1. Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).
  9. Melief, C. J. Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming. Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).
  10. Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annu Rev Immunol. 25, 297-336 (2007).
  11. Benlagha, K., Bendelac, A. CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity. Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).
  12. Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
  13. Arora, P., et al. A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens. Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).
  14. Semmling, V., et al. Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs. Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).
  15. Duriancik, D. M., Hoag, K. A. The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer’s patches using flow cytometric analysis. Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).
  16. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).
  17. Mach, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).
  18. Vremec, D., Segura, E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).
  19. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
  20. Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  21. Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  22. Vremec, D., et al. Maintaining dendritic cell viability in culture. Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).

Play Video

Citar este artículo
Arora, P., Porcelli, S. A. An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets. J. Vis. Exp. (110), e53824, doi:10.3791/53824 (2016).

View Video