على طريقة العائد فعالة وعالية لعزل مجموعات فرعية خلية الفأر الجذعية
Summary
Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.
Abstract
الخلايا الجذعية (DCS) هي المهنية الخلايا المقدمة للمستضد المسؤولة في المقام الأول لاكتساب ومعالجة وعرض المستضدات على مستضد الجزيئات لبدء الحصانة بوساطة الخلايا التائية. الخلايا الجذعية يمكن تقسيمها إلى عدة مجموعات فرعية ظاهريا وغير متجانسة وظيفيا. ثلاث مجموعات فرعية مهمة من الخلايا الجذعية الطحال هي بلازماوية الشكل، وخلايا CD8α نقاط البيع وCD8α NEG. في البلدان النامية بلازماوية الشكل والمنتجين الطبيعي الإنترفيرون من النمط الأول ومهمة لمكافحة الفيروسات مناعة الخلايا التائية. فرعية CD8α NEG العاصمة متخصصة لMHC من الدرجة الثانية تقديم المستضد وشملت مركزي في فتيلة خلايا CD4 T. وCD8α نقاط البيع البلدان النامية هي المسؤولة في المقام الأول عن عبر تقديم المستضدات الخارجية وCD8 T فتيلة الخلية. وقد أظهرت CD8α نقاط البيع البلدان النامية أن تكون أكثر كفاءة في تقديم المستضدات شحمي سكري جزيئات CD1d إلى سل تي المتخصصةالسكان ل المعروفة باسم ثابتة القاتلة الطبيعية خلايا T (iNKT). إدارة FLT-3 يجند يزيد من وتيرة هجرة الأسلاف الخلايا الجذعية من نخاع العظام، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى توسيع الخلايا الجذعية في الأعضاء الليمفاوية الطرفية في نماذج الفئران. تكيفنا هذا النموذج لتنقية أعداد كبيرة من الخلايا الجذعية وظيفية لاستخدامها في التجارب نقل خلية للمقارنة في الجسم الحي الكفاءة من مجموعات فرعية العاصمة مختلفة.
Introduction
تم اكتشاف الخلايا الجذعية (DC) منذ ما يقرب من أربعين عاما باسم "النجمية الكبيرة (تغصن اليوناني) خلية" وجدت في الأجهزة اللمفاوية 1. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن البلدان النامية هي خلايا مقدمة للمستضد الوحيدة التي يمكن أن تحفز على نحو فعال خلايا T ساذجة 2. والمهمة الرئيسية لهذه الخلايا هي امتصاص وعرض المستضدات والمعالجة بكفاءة وتحميل هذه على تقديم المستضد الجزيئات. في الطحال الماوس، البلدان النامية يمكن فصلها إلى بلازماوية الشكل وفرعية التقليدية. وتتميز البلدان النامية بلازماوية بانخفاض التعبير عن CD11c وومستويات عالية من B220 وGR-1. بل هي أيضا إيجابية للسطح علامة mPDCA1 وتفرز النوع الأول الإنترفيرون ردا على حصيلة مثل مستقبلات 9 (TLR9) بروابط. في البلدان النامية التقليدية مرتفعة عن CD11c ووMHC من الدرجة الثانية التعبير. ويمكن تقسيمها إلى ثلاث مجموعات فرعية مختلفة تعتمد على التعبير عن سطح علامات المظهرية مثل CD4، CD8α، DEC205، CD11B والخلايا الجذعية مستقبلات المثبطة 2 (DCIR2، معترف بها من قبل الأجسام المضادة 33D1) البروتينات 3،4. ومن المعروف أيضا CD8α نقاط البيع البلدان النامية كما cDC1، هي ايجابية لDEC205، ولكن سلبية لعلامات الدم النخاعي مثل CD11b و33D1. وCD8α NEG البلدان النامية، كما دعا cDC2، إيجابية ل33D1، CD11b وCD4 ولكنها تفتقر DEC205. فرعية سلبية مزدوجة (أي سلبية لكلا CD4 وCD8α) هي نادرة نسبيا، وسلبية للDEC205 و33D1. هو أقل فرعية السمات التي تميزت وقد يكون شكلا أقل تميزا من CD8α NEG العاصمة.
الاختلافات المظهرية في مختلف مجموعات فرعية العاصمة تمتد أيضا إلى وظائفهم في الجسم الحي. وCD8α NEG البلدان النامية هي أكلة للغاية ويعتقد أن تقديم مستضد خارجي أساسا عن طريق معقد التوافق النسيجي الكبير الثاني لخلايا CD4 T 3. في المقابل، في نقاط البيع البلدان النامية CD8α هي متخصصة لتقديم المستضد البروتين القابلة للذوبان على MHC الصف الأولفي آلية تسمى عبر العرض. نتائج عبر العرض يعتمد على حالة تفعيل هذه البلدان النامية 5، وإما أن تؤدي إلى توسيع الخلايا التائية السامة (CTLs) أو تطور الخلايا التائية التنظيمية 6 2،7. استهداف مستضد إلى CD8α نقاط البيع البلدان النامية استخدام نتائج تسليم بوساطة مكافحة DEC205 الضد إلى حد كبير في حذف خلايا تي 8، في حين عرض المستضدات المشتقة من الخلايا أفكارك المصابة يؤدي الى CTL استجابة قوية 9.
بالإضافة إلى الاعتراف مستضدات الببتيد، تطورت الجهاز المناعي الثدييات الاعتراف الدهون ومولدات المضادات شحمي سكري. يتم عرض هذه المستضدات من قبل جزيئات CD1، التي هي معقد التوافق النسيجي الكبير الطبقة أحب بروتينات سطح الخلية الموجودة في النماذج الخاصة المتعددة في مختلف الثدييات. في الفئران، ونوع واحد من الحفظ جدا جزيء CD1 دعا CD1d هو المسؤول عن تقديم المستضدات شحمي سكري 10. الاختصاص ويطلق السكان من خلايا تي التي تعترف CD1d / المجمعات شحمي سكري خلايا NKT ثابتة (خلايا iNKT). هذه الخلايا تعبر عن شبه ثابتة مستقبلات الخلايا التائية (TCR) يتألف من سلسلة TCRα ثابتة أن يقترن مع سلاسل TCRβ التي التنوع 11 محدودة. وخلافا للخلايا T التقليدية التي تحتاج لتتكاثر والتفريق لتصبح تنشيط خلايا T المستجيب، وجود خلايا iNKT باعتبارها السكان المستجيب وتبدأ الاستجابة بسرعة بعد تناوله شحمي سكري 12. تحديد الخلايا مستضد الدهون ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية هي منطقة نشطة للبحث، لذا تم اقتراح العديد من أنواع الخلايا المتميزة مثل B الخلايا، الضامة والبلدان النامية لأداء هذه المهمة. ومع ذلك، وقد تبين أن مجموعة فرعية CD8α نقاط البيع من البلدان النامية هي الخلية الأساسية التوسط امتصاص وعرض المستضدات الدهون في خلايا فأر iNKT 13 و شحمي سكري بوساطة عبر فتيلة من خلايا CD8 T 14.
ove_content "> لمقارنة كفاءة تقديم المستضد من قبل مختلف خلايا مقدمة للمستضد، نهج مباشرة هو لنقل أنواع مختلفة من ناقلات الجنود المدرعة النقاء نابض مع المبالغ المعادلة المستضد إلى المضيفين السذاجة. وغالبا ما يتم إجراء تجارب نقل خلية من هذا النوع للدراسات المناعية. ومع ذلك، إجراء الدراسات نقل مع البلدان النامية خارج الحي مستضد تعامل يشكل تحديا، لأن هذه الخلايا موجودة السكان نادرة كما هو الحال في الأجهزة اللمفاوية حيث أنها تشكل أقل من 2٪ من مجموع الخلايا (15). ولذا فمن الضروري تعزيز تطوير هذه الخلايا في الحيوانات المانحة لزيادة كفاءة بروتوكولات العزلة.ومن المعروف أن اللمفاوية المشترك والأسلاف النخاعي المشتركة، التي مطلوبة من أجل جيل من الحزب الديمقراطي المسيحي، CD8 نقاط البيع وفرعية CD8 NEG العاصمة، صريحة تتعلق FMS مستقبلات التيروزين كيناز 3 (FLT-3). عليها في الجسم الحي FLT-3 يجند (FLT-3L) الإدارة، emigratوزيادة أيون من FLT-3 معربا عن الخلايا السلف من نخاع العظام، مما أدى إلى زيادة البذر من الأعضاء الليمفاوية الطرفية وتوسيع بهم ناضجة العاصمة ذرية 16. يتم فقدان التعبير عن FLT-3 خلال الالتزام B، T أو NK مسارات تمايز الخلايا. لذلك، لوحظ فقط الحد الأدنى من التعديلات في هذه الخلايا على إدارة FLT-3L. لوحظ توسع مماثل في السكان في العاصمة الفئران تحمل الأورام الناتجة عن زرع خط الخلية B16-سرطان الجلد إفراز الفئران FLT-3L، الذي يوفر طريقة بسيطة واقتصادية لتوفير مستويات النظامية مستمرة من FLT-3L 17،18. باستخدام هذا النهج، قمنا بتطوير بروتوكول على أساس زرع الخلايا B16-سرطان الجلد إفراز FLT-3L لتحفيز التوسع في جميع مجموعات فرعية العاصمة العادية في الطحال الماوس، وبالتالي زيادة كبيرة في العوائد من هذه الخلايا التي يمكن أن تكون معزولة عن تجارب لاحقة . نجد دائما أنه في غضون 10-14 يوما بعد ايم تحت الجلدمزرعة للورم إفراز FLT-3، والفئران تطوير تضخم الطحال مع تخصيب ملحوظ في البلدان النامية تشكل 40 – 60٪ من مجموع خلايا الطحال. من هذه الطحال، مجموعات فرعية العاصمة مختلفة يمكن أن تكون معزولة مع نقاء عالية باستخدام معيار المتاحة تجاريا مجموعات تنقية الخلايا التي تستخدم علامات المظهرية-فرعية معينة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتقبل الخلايا الجذعية ليكون المستضد المهنية الرئيسية تقديم الخلايا المشاركة في فتيلة من ردود الخلايا التائية. وظيفتها الرئيسية هي لمسح المكروية الأنسجة عن طريق تناول ومعالجة المستضدات لعرضها على خلايا تي. من أجل دراسة وظيفة فرعية العاصمة محددة، وهذه تحتاج إلى أن ت?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIAID منحة AI45889 إلى SAP التدفق الخلوي وأجريت دراسات من استخدام المرافق الأساسية FACS بدعم من مركز أينشتاين السرطان (NIH / NCI CA013330) ومركز لأبحاث الإيدز (NIH / NIAID AI51519).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al. ,2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media | |||
| 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer: | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000- |
2,000 Units of collagenase activity per ml This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use |
Referencias
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Dudziak, D., et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 315 (5808), 107-111 (2007).
- Belz, G. T., Nutt, S. L. Transcriptional programming of the dendritic cell network. Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).
- den Haan, J. M., Bevan, M. J. Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo. J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Yamazaki, S., et al. CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).
- Mukherjee, G., et al. DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1. Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).
- Melief, C. J. Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming. Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annu Rev Immunol. 25, 297-336 (2007).
- Benlagha, K., Bendelac, A. CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity. Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Arora, P., et al. A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens. Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).
- Semmling, V., et al. Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs. Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).
- Duriancik, D. M., Hoag, K. A. The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer’s patches using flow cytometric analysis. Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).
- Mach, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).
- Vremec, D., Segura, E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Vremec, D., et al. Maintaining dendritic cell viability in culture. Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).
