Summary

Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

Published: April 18, 2016
doi:

Summary

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Abstract

Dendritische cellen (DCs) zijn professionele antigeen presenterende cellen hoofdzakelijk verantwoordelijk voor het verkrijgen, verwerken en presenteren van antigenen op antigeenpresenterende moleculen aan T-cellen gemedieerde immuniteit te initiëren. Dendritische cellen kunnen worden gescheiden in verschillende fenotypisch en functioneel heterogene subgroepen. Drie belangrijke subsets van milt dendritische cellen zijn plasmacytoide, CD8a Pos en CD8a Neg cellen. De plasmacytoïde DCs natuurlijke producenten van type I interferon en zijn belangrijk voor antivirale T cel immuniteit. De CD8a Neg DC deelverzameling is gespecialiseerd voor MHC klasse II antigeen presentatie en is centraal betrokken in priming CD4 T-cellen. De CD8a Pos DCs zijn primair verantwoordelijk voor cross-presentatie van exogene antigenen en CD8 T-cel priming. De CD8a Pos DC aangetoond efficiënt bij de presentatie glycolipide antigenen door CD1d moleculen om een specifieke T cell bevolking bekend als onveranderlijk natural killer T (iNKT) cellen. Toediening van Flt-3-ligand verhoogt de frequentie van migratie van dendritische cellen uit beenmerg progenitoren uiteindelijk resulteert in het vergroten van dendritische cellen in perifere lymfoïde organen in muizenmodellen. We hebben dit model aangepast aan grote aantallen functionele dendritische cellen te zuiveren voor gebruik in celoverdracht experimenten ter vergelijking in vivo vaardigheid van verschillende DC subsets.

Introduction

Dendritische cellen (DC) werden ontdekt bijna veertig jaar geleden als "grote stervormige (Griekse dendron) cel" in lymfoïde organen 1. Vele studies hebben aangetoond dat DCs de enige antigeen presenterende cellen die effectief naïeve T-cellen 2 kunnen stimuleren. Een belangrijke functie van deze cellen is de opname en presentatie van antigenen en de efficiënte verwerking en het laden van deze op antigeen presenterende moleculen. In muis milt, kan DC worden gescheiden in plasmacytoide en conventionele subsets. De plasmacytoide DCs worden gekenmerkt door lage expressie van CD 11 c en een hoog niveau van de B220 en Gr-1. Ze zijn ook positief voor de oppervlakte marker mPDCA1 en scheiden type I interferon in reactie op toll-like receptor 9 (TLR9) liganden. De conventionele DC's zijn hoog voor CD11c en MHC klasse II expressie. Zij kunnen worden verdeeld in drie subgroepen op basis van de oppervlakte-expressie van fenotypische merkers zoals CD4, CD8a, DEC205, CD11b en dendritische celtherapie remmende receptor 2 (DCIR2, erkend door de 33D1-antilichaam) eiwitten 3,4. De CD8a Pos DCs worden ook wel CDC1, zijn positief voor DEC205, maar negatief voor myeloïde merkers zoals CD11b en 33D1. De CD8a Neg DC's, ook wel cdc2, zijn positief voor 33D1, CD11b en CD4, maar gebrek aan DEC205. De dubbele negatieve subgroep (dwz negatief voor zowel CD4 en CD8a) is relatief zeldzaam, en is negatief voor DEC205 en 33D1. Het de minst gekarakteriseerde subgroep en kunnen minder gedifferentieerde vorm van CD8a Neg gelijkstroom.

Fenotypische verschillen in de verschillende DC subsets worden uitgebreid tot de in vivo functies. De CD8a Neg DCs sterk fagocytische en men denkt dat exogeen antigen zetten vooral via MHC klasse II aan CD4 T-cellen 3. In tegenstelling, de CD8a Pos DCs zijn gespecialiseerd voor het aanbrengen van oplosbaar eiwit antigeen op MHC klasse Ieen mechanisme genaamd cross-presentatie. Het resultaat van cross-presentatie is afhankelijk van de activeringsstatus van deze DCs 5, en kan zowel leiden tot uitbreiding van cytotoxische T-cellen (CTL's) of de ontwikkeling van regulerende T-cellen 6 2,7. Targeting van antigeen aan CD8a Pos DCs met behulp van anti-DEC205-antilichaam-gemedieerde levering resultaten grotendeels in de verwijdering van T-cellen 8, terwijl de presentatie van de antigenen afkomstig van geïnfecteerde apoptotische cellen een sterke CTL-respons 9 induceert.

Naast herkenning van peptide-antigenen is het immuunsysteem van zoogdieren ontwikkeld om lipide en glycolipide antigenen herkennen. Deze antigenen worden door CD1 moleculen, die MHC klasse I-achtige celoppervlakte-eiwitten die bestaan ​​in verschillende verwante vormen in diverse zoogdieren. In muizen, één soort sterk geconserveerde CD1 molecuul genaamd CD1d is verantwoordelijk voor de presentatie glycolipide antigenen 10. De burgemeester populatie van T-cellen die CD1d / glycolipide complexen herkennen heet invariante NKT cellen (iNKT cellen). Deze cellen brengen een semi-invariante T-celreceptor (TCR), bestaande uit een invariant TCRα keten die is gekoppeld aan TcR ketens met een beperkte diversiteit 11. In tegenstelling tot conventionele T-cellen die moeten groeien en te differentiëren tot geactiveerde effector-T-cellen, iNKT cellen bestaan ​​als een effector bevolking en begint snel te reageren na glycolipide toediening 12. Identificatie van fysiologisch relevante lipide antigeenpresenterende cellen is een actief gebied van onderzoek en een aantal verschillende celtypes zoals B-cellen, macrofagen en DC's zijn voorgesteld voor deze functie. Er werd aangetoond dat de CD8a Pos subset van DC is de primaire cel medieert opname en presentatie van lipide antigenen muizen- iNKT cellen 13 en glycolipide gemedieerde cross-priming van CD8 T-cellen 14.

ove_content "> Om de efficiëntie van antigeenpresentatie vergelijken met andere antigeenpresenterende cellen, een eenvoudige aanpak is om verschillende gezuiverde APCs gepulst met equivalente hoeveelheden van antigeen in naïeve gastheer. celoverdracht experimenten van dit type worden vaak uitgevoerd voor immunologische studies te dragen. echter, het uitvoeren van overdracht studies ex vivo antigeen behandelde DCs uitdaging, aangezien deze cellen bestaan ​​zeldzame populaties in lymfoïde organen, waar ze minder dan 2% van de totale cellen 15 vormen. daarom moet de ontwikkeling van deze cellen in donordieren verbeteren de efficiëntie van isolatie protocollen te verhogen.

Het is bekend dat de gemeenschappelijke lymfoïde en myeloïde voorlopercellen gemeenschappelijke, die nodig zijn voor het genereren van pDC, CD8 en CD8 Pos Neg DC subsets, express fms-gerelateerde tyrosine kinase receptor 3 (Flt-3). Bij het ​​in vivo Flt-3-ligand (Flt-3L) administratie, emigration van Flt-3 tot expressie stamcellen uit beenmerg wordt verhoogd, leidt tot een toegenomen zaaien van perifere lymfoïde organen en de uitbreiding van de rijpe DC 16 nageslacht. Expressie van Flt-3 is verloren tijdens betrokkenheid bij de B, T of NK-celdifferentiatie paden. Daarom worden slechts minimale veranderingen waargenomen in deze cellen op Flt-3L administratie. Vertaald expansie DC populaties waargenomen in muizen die tumoren opgewekt door implantatie van B16-melanoom cellijn afscheidende muis Flt-3L, welke een eenvoudige en economische methode voor het verschaffen van langdurige systemische niveaus van Flt-3L 17,18 bepaalt. Met deze benadering hebben we een protocol gebaseerd op de implantatie van B16-melanoom cellen die Flt-3L de uitbreiding van alle normale DC subsets in muismilt stimuleren, waardoor aanzienlijke verhoging van de opbrengst van deze cellen kunnen worden geïsoleerd voor verdere experimenten ontwikkeld . We consequent vinden dat binnen 10 – 14 dagen na subcutane implantage van de Flt-3 afscheidende tumor, muizen ontwikkelen splenomegalie met duidelijke verrijking van DC tot 40 vormen – 60% van de totale miltcellen. Uit deze milt kunnen verschillende DC subsets worden geïsoleerd met hoge zuiverheid met behulp van standaard in de handel verkrijgbare cel zuivering kits die subgroep-specifieke fenotypische markers in dienst.

Protocol

Dierproeven worden gedaan in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen van de institutionele dierlijke zorg en gebruik commissie (IACUC). Alle procedures die de steriliteit worden uitgevoerd in een bioveiligheid kast. 1. Implantatie van B16.Flt3L Melanoma in Muizen Cultuur de Flt-3 expressie brengende B16 melanoma cellijn T25 weefselkweek flessen in een dichtheid van 0,5 x 10 6 cellen / ml in compleet DMEM medium met 10% CO2 bij 37 ° C. Opgroeien tot d…

Representative Results

Het resultaat van deze procedure is gebaseerd op de groei van DC subsets van murine Flt-3L door de geïmplanteerde melanoomcellen expressie. De B16.Flt3L tumor werd afgeleid van een C57BL / 6 muis en worden geïmplanteerd in dieren die stamachtergrond om falen van de tumor te vestigen door afstoting te voorkomen. In sommige gevallen kan het gewenst zijn genetisch gemodificeerde muizen om DCs met bekende defecten leiden in signaalwegen of receptoren van belang. Het is belangrijk om in ged…

Discussion

Dendritische cellen worden toegelaten tot de grootste professionele antigenpresenterende cellen betrokken bij het priming van T-cel responsen zijn. Hun belangrijkste functie is om het weefsel micro onderzoek van opnemen en verwerken van antigenen voor presentatie aan T-cellen. Om de functie van specifieke DC subsets bestuderen, moeten deze in voldoende aantallen te isoleren Daarbij moet misschien hun normale fenotype en functie handhaaft. De meeste protocollen vertrouwen op de isolatie van specifieke subgroep van DC na?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door NIH / NIAID subsidie ​​AI45889 naar SAP Flowcytometrie studies met behulp van FACS kernfaciliteiten ondersteund door de Einstein Cancer Center (NIH / NCI CA013330) en het Center for AIDS Research (NIH / NIAID AI51519) werden uitgevoerd.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA  Life Technologies, Gibco 25300-054
Isoflurane  Sigma-Aldrich CDS019936-250MG
Collagenase D  Roche Diagnostics 11088858001
DNase I (dry powder) QIAGEN 79254
200 proof ethanol  Thermo Fisher Scientific 9-6705-004-220 Used to prepare 70% ethanol
RBC lysis buffer Sigma-Aldrich R7757
RPMI-1640 medium with L-glutamine  Life Technologies, Gibco 11875-119
DMEM medium with L-glutamine  Life Technologies, Gibco 11995-073
200 mM L-glutamine  Life Technologies 25030081
MEM non-essential amino acids  Life Technologies, Gibco 11140-050
MEM essential amino acids  Life Technologies 11130-051 
β-mercaptoethanol  Life Technologies, Invitrogen 21985-023
Sodium pyruvate  Life Technologies 11360-070
HEPES  Life Technologies, Invitrogen 15630
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) Life Technologies, Invitrogen 20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) Life Technologies, Gibco 14040-182
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution  Life Technologies 15575-020
Bovine serum albumin (BSA)  Sigma-Aldrich A2153
Fetal calf serum Atlanta Biologicals S11050 
Penicillin/streptomycin  Life Technologies, Invitrogen 15140-163
Trypan blue (dry powder)  Sigma-Aldrich T6146-5G  Prepare 0.08% with PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse Miltenyi Biotech 130-092-786
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c  Miltenyi Biotech 130-152-001
CD8αPos mouse DC isolation kit  Miltenyi Biotech 130-091-169
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) BD Biosciences 553141
Anti-mouse CD11c-FITC  BD Biosciences 553801
Anti-mouse CD8α-PerCP  BD Biosciences 553036
Anti-mouse B220-PE  BD Biosciences 553090
1 ml syringes  BD 26048
23 G1 needle  BD 305145
100 mm Petri dishes  Thermo Fisher Scientific 875712
Surgical instruments  Kent Scientific INSMOUSEKIT
Cell strainer (70 µm  BD 352350
Large Petri plates  Thermo Fisher Scientific FB0875712
Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um  Corning 431097
LS columns  Miltenyi 130-042-401
Magnetic stand MACS separator  Miltenyi Biotec 130-042-302
Wide-bore 200 μl pipette tips  PerkinElmer 111623
Corning ultra-low attachment 96-well plates  Corning CLS3474-24EA
6-8 week old female C57BL/6 mice  Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L melanoma cell line described by Mach et al. ,2000
Serum free DMEM and RPMI media
500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine

5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM)    

5 ml HEPES Buffer (1 M)    

5 ml L-glutamine (200 mM) 

0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need.  Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system.
Complete RPMI and DMEM media Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.
MACS buffer:  Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). 
FACS staining buffer Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution
Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000-
2,000 Units of collagenase activity per ml

This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use

Referencias

  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  3. Dudziak, D., et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 315 (5808), 107-111 (2007).
  4. Belz, G. T., Nutt, S. L. Transcriptional programming of the dendritic cell network. Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).
  5. den Haan, J. M., Bevan, M. J. Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo. J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).
  6. Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
  7. Yamazaki, S., et al. CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).
  8. Mukherjee, G., et al. DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1. Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).
  9. Melief, C. J. Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming. Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).
  10. Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annu Rev Immunol. 25, 297-336 (2007).
  11. Benlagha, K., Bendelac, A. CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity. Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).
  12. Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
  13. Arora, P., et al. A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens. Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).
  14. Semmling, V., et al. Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs. Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).
  15. Duriancik, D. M., Hoag, K. A. The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer’s patches using flow cytometric analysis. Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).
  16. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).
  17. Mach, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).
  18. Vremec, D., Segura, E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).
  19. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
  20. Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  21. Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  22. Vremec, D., et al. Maintaining dendritic cell viability in culture. Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).

Play Video

Citar este artículo
Arora, P., Porcelli, S. A. An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets. J. Vis. Exp. (110), e53824, doi:10.3791/53824 (2016).

View Video