Summary

La purificación de los buques de cerebro de ratón

Published: November 10, 2015
doi:

Summary

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain’s vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Abstract

En el cerebro, la mayor parte del sistema vascular consiste en una barrera selectiva, la barrera hematoencefálica (BBB) ​​que regula el intercambio de moléculas y células inmunes entre el cerebro y la sangre. Por otra parte, la enorme demanda metabólica neuronal requiere una regulación de momento a momento del flujo sanguíneo. Cabe destacar que las anomalías de estas regulaciones son características etiológicas de la mayoría de las patologías cerebrales; incluyendo glioblastoma, accidente cerebrovascular, edema, epilepsia, enfermedades degenerativas (por ejemplo: enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer), tumores cerebrales, así como las condiciones inflamatorias tales como esclerosis múltiple, meningitis y disfunciones cerebrales sepsis inducida. Por lo tanto, la comprensión de los eventos de señalización que modulan la fisiología vascular cerebral es un gran desafío. Mucho penetración en las propiedades celulares y moleculares de los diversos tipos de células que componen el sistema cerebrovascular se puede obtener de cultivo primario o clasificación de células a partir de tejido cerebral recién disociada. Sin embargo,propiedades tales como la polaridad celular, la morfología y relaciones intercelulares no se mantienen en tales preparaciones. El protocolo que se describe aquí está diseñado para purificar fragmentos de vasos del cerebro, mientras que el mantenimiento de la integridad estructural. Se demuestra que los vasos aislados consisten en células endoteliales sellados por uniones estrechas que están rodeados por una lámina basal continua. Los pericitos, células de músculo liso, así como las membranas de astrocitos perivasculares endfeet permanecen unidos a la capa endotelial. Por último, se describe cómo llevar a cabo experimentos de inmunotinción en vasos cerebrales purificados.

Introduction

El funcionamiento adecuado del sistema nervioso central (SNC) requiere un entorno extracelular altamente regulado, y sus demandas metabólicas son enormes en comparación con otros órganos 1. El SNC es también extremadamente sensibles a una amplia gama de productos químicos, generalmente inofensivo para los órganos periféricos, pero a la misma, neurotóxico. Para garantizar el correcto funcionamiento, la mayor parte del 'vasculatura SNC forma una barrera endotelial; la barrera hematoencefálica (BBB), que controla el flujo de moléculas e iones, así como el paso de las células inmunes entre la sangre y el cerebro, lo que se mantiene la homeostasis adecuada 2, sino también limitar la entrada de drogas terapéuticas, los tratamientos que impiden por lo tanto de trastornos neurológicos 3. A nivel celular, la BBB se sostiene principalmente por extensas uniones estrechas entre las células endoteliales, la expresión de los transportadores de eflujo polarizado y una tasa muy baja transcitosis 4. Propiedades y funciones de la BBB se inducen principalmente por necélulas ighboring 4. En particular, los pericitos juegan un papel importante en la inducción y mantenimiento de la BBB 5,6. Siendo células contráctiles, pericitos también regulan el flujo sanguíneo 7 al igual que las células del músculo liso que rodean los grandes vasos. Por último, los astrocitos, las principales células gliales del cerebro, enviar grandes procesos denominados endfeet alrededor de la mayor parte de la vasculatura del cerebro 8 y modular la acreditación integridad y la quiescencia inmune 9, la transferencia de metabolitos a las neuronas 10, e inducir el estrecho acoplamiento entre la actividad neuronal y el flujo de sangre 11,12.

La capacidad para estudiar las propiedades moleculares y celulares del sistema cerebrovascular es crucial para caracterizar mejor su contribución a la fisiología del cerebro y la fisiopatología. Para abordar esta cuestión, las estrategias para aislar el sistema vascular cerebral del cerebro se han desarrollado, que permite la preparación de fragmentos de vasos cerebrales intactas. Cerebral buque purification fue descrito inicialmente utilizando cerebros bovinos 13 y mejorado y adaptado a otras especies, en particular los roedores 14. En este último estudio, se introdujo el uso de filtros de diferentes tamaños para separar los vasos cerebrales en al fracciones enriquecidas en los vasos de diferentes diámetros. Curiosamente, en estas preparaciones, las células endoteliales mantienen sus propiedades metabólicas 15, funcionalidad transportador 16 y 17 de polarización. A continuación, describimos en detalle este protocolo y demostrar, además, que los vasos aislados conservan la mayor parte de sus estructuras en situ. Las células endoteliales se mantienen unidos por uniones estrechas y rodeado por una lámina basal continua. Pericitos y células musculares lisas de permanecer unidos a la capa endotelial, así como de astrocitos perivasculares membranas. Sin embargo, se eliminan astrocitos, células microgliales, neuronas y oligodendrocitos. Por último, se describe un procedimiento para llevar a cabo la inmunotinción en vasos cerebrales aisladas. </p>

Hasta ahora la mayoría de los estudios moleculares y celulares en relación con el sistema cerebrovascular se han realizado en células de los vasos cerebrales purificados disociados por la célula de clasificación utilizando cepas reportero ratón específicos de células o procedimientos basados ​​en inmunotinción 18,19. Aunque estas técnicas permite el aislamiento de las poblaciones de células cerebrovasculares casi puros, células aisladas pierden por completo su in situ morfología y las interacciones, que a su vez, afecta en gran medida sus propiedades moleculares y celulares. El protocolo descrito aquí, lo que permite el aislamiento de fragmentos cerebrovasculares enteros sin necesidad de anticuerpos específicos o manchas de ratones transgénicos, ofrece una buena alternativa como la estructura general de los vasos cerebrales aisladas se conserva, por lo tanto, disminuyendo repercusiones sobre sus propiedades moleculares. Vasos aislados podrían entonces ser utilizados para el estudio de la actividad genética, la síntesis de proteínas y la regulación de la acreditación como se ha descrito recientemente 20,21 </sup>. Por último, en comparación con láser captura microdissection 22,23 del presente protocolo es barato, fácil de realizar y rápidamente adaptables a cualquier laboratorio.

Protocol

1. Soluciones y Materiales Preparar soluciones de los vasos de aislamiento: B1, añadir 1,5 ml de HEPES 1 M a 150 ml de HBSS; B2, añadir 3,6 g de dextrano a 20 ml de B1; B3, añadir 1 g de BSA a 100 ml de B1. Modificar el soporte del filtro mediante la reducción de la parte inferior de la parte superior de atornillado. Preparar soluciones de inmunotinción: solución de fijación, 4% de paraformaldehído en PBS pH 7,4; Permeabilización / solución de bloqueo, diluir suero de cabra al 5%…

Representative Results

Aquí se describe un protocolo que permite el aislamiento mecánico de los vasos cerebrales 14. Figura 1 resume las principales etapas de esta técnica. La arquitectura de los vasos cerebrales es compleja e incluye varios tipos de células, es decir, células endoteliales sellados por uniones estrechas y rodeados por pericitos, células musculares lisas, y procesos de pie 9 de astrocitos. Por lo tanto, después del aislamiento de los vasos cerebrales, que tuvo como objetiv…

Discussion

La barrera sangre-cerebro regula el paso de sustancias fisiológicas dentro y fuera del SNC y lo protege contra sustancias potencialmente nocivas presentes en la sangre. Está implicado en varias patologías del sistema nervioso central, incluyendo enfermedades neurodegenerativas 2 y 28 tumores cerebrales. La muy baja permeabilidad de la BHE también dificulta el paso de agentes terapéuticos dirigidos células neuronales y el desarrollo de métodos que tengan la intención de abrir de forma reversible la BHE…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Labex MemoLife y por el ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclérose en plaques)

Materials

Tissue Grinder Size C Thomas scientific 3431E25
centrifuge 5415 R Eppendorf
centrifuge 5810 R Eppendorf 5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope Leica MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 Leica LED1000
low binding tips (P1000) Sorenson BioScience 14200T
Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk Millipore SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20µm 47mm 100/Pk Millipore NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100µm 47mm 100/Pk Millipore NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing Sutter Instrument B150-86-7.5
Microscope Slides Thermo Scientific 1014356290F
Cover Slips, Thickness 1 Thermo Scientific P10143263NR1
0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap Thermo Scientific AB-0266
 PARAFILM® M (roll size 4 in. × 125 ft) Sigma P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Life technology 14175-129
HEPES (1M) Life technology 15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 Sigma 31390
Bovine serum albumin Sigma A2153
PBS 10X Euromedex ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free  Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Sigma X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma 14533
Mounting medium Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor® 488 Conjugate; Dilution 1/100 Life technology I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) Life technology 33-9100 dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) Sigma A2547  dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5) Sigma G3893  dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit) Sigma A5971  dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2) BD Biosciences 610061  dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit) Millipore AB9610  dilution 1:200
Anti NF-M (mouse) provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.  dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit) Wako 019-19741  dilution 1:400
Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A11029  dilution 1:2000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate Life technology A11034  dilution 1:2000
Alexa Fluor® 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A21424  dilution 1:2000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate Life technology A21429  dilution 1:2000

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Citar este artículo
Boulay, A., Saubaméa, B., Declèves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (105), e53208, doi:10.3791/53208 (2015).

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