Zuivering van Mouse Brain Schepen

De correcte werking van het centrale zenuwstelsel (CNS) is een sterk gereguleerd extracellulaire omgeving en zijn metabole eisen zijn groot in vergelijking met andere organen ^1. Het CNS is ook zeer gevoelig voor een groot aantal chemicaliën, algemeen onschadelijk perifere organen maar om het, neurotoxisch. Om een ​​correcte werking te garanderen, de meeste van de CNS 'vaatstelsel vormt een endotheliale barrière; de bloed-hersenbarrière (BBB), die de stroom van moleculen en ionen en de passage van immuuncellen tussen bloed en hersenen controleert, waardoor goede homeostase ² handhaven, maar ook beperken van de intrede van therapeutische geneesmiddelen, waardoor belemmerd behandelingen neurologische aandoeningen ^3. Op cellulair niveau wordt de BBB voornamelijk ondersteund door uitgebreide tight junctions tussen endotheelcellen, gepolariseerde expressie van efflux transporters en een zeer lage prijs transcytose ^4. Eigenschappen en functies van de BBB worden meestal veroorzaakt door neighboring cellen ^4. Vooral pericytes een belangrijke rol spelen bij het ​​induceren en handhaven van de BBB ^5,6. Omdat contractiele cellen, pericyten reguleren ook de doorbloeding ⁷ net als de gladde spiercellen omliggende grote schepen. Tenslotte astrocyten, grote gliale cellen van de hersenen, om grote processen eindvoetjes van astrocyten ongeveer uitgeroepen meeste hersenen vasculatuur ⁸ en moduleren BBB integriteit en immune rust ^9, de overdracht van metabolieten neuronen ^10, en induceren de nauwe koppeling tussen neuronale activiteit en bloedstroom ^11,12.

De mogelijkheid om de moleculaire en cellulaire eigenschappen van het cerebrovasculaire systeem bestuderen cruciaal is om beter te karakteriseren zijn bijdrage aan de hersenen en fysiopathologie. Om deze vraag te pakken, hebben strategieën om cerebrovasculaire systeem van de hersenen te isoleren ontwikkeld, die het mogelijk maken voor de voorbereiding van de intacte fragmenten hersenen vat. Cerebrale vaartuig purification werd aanvankelijk beschreven met boviene hersenen ¹³ en verbeterd en aangepast aan andere diersoorten, vooral knaagdieren ^14. In dit laatste onderzoek, het gebruik van filters van variërende grootte werd geïntroduceerd hersenvaten in fracties verrijkt in vaten van verschillende diameters te scheiden. Interessant is dat in dergelijke preparaten, endotheelcellen hielden hun metabolische eigenschappen ^15, transporter functionaliteit ¹⁶ es ¹⁷ polarisatie. Hier beschrijven we in detail dit protocol en verder aan te tonen dat geïsoleerde schepen de meeste van hun behoud in situ constructies. Endotheelcellen blijven verbonden door krappe kruispunten en omgeven door een continue basale lamina. Pericyten en gladde spiercellen blijven de endotheliale laag, evenals perivasculaire astrocyten membranen bevestigd. Echter, astrocyten, microgliacellen, neuronen en oligodendrocyten geëlimineerd. Tenslotte beschrijven we een procedure uit te voeren immunokleuring op geïsoleerde vaten hersenen. </p>

Tot nu toe de meeste van de moleculaire en cellulaire studies over de cerebrovasculaire systeem zijn uitgevoerd op gezuiverd hersenen vat cellen gedissocieerd door-celsortering gebruik van mobiele specifieke reporter muis stammen of-immunokleuring gebaseerde procedures ^18,19. Hoewel deze technieken maakt de isolatie van bijna zuiver cerebrovasculaire celpopulaties, geïsoleerde cellen volledig verliezen hun in situ morfologie en interacties, die op hun beurt sterk hun moleculaire en cellulaire eigenschappen beïnvloedt. Het protocol hier beschreven, waardoor de isolatie van hele cerebrovasculaire fragmenten zonder de noodzaak van specifieke antilichamen en transgene muizen vlekken, een goed alternatief de algemene structuur van geïsoleerde hersenvaten behouden dus vermindering weerslag op hun moleculaire eigenschappen. Geïsoleerde schepen kunnen dan worden gebruikt voor het bestuderen van de activiteit van genen, eiwitsynthese en regelgeving op de BBB zoals onlangs beschreven ^20,21 </sup>. Tot slot, in vergelijking met lasermicrodissectie ^22,23 het huidige protocol is goedkoop, gemakkelijk uit te voeren en snel aanpasbaar aan een laboratorium.