Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.
Antigen inexperienced (naïve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a naïve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during naïve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of naïve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing naïve cells to various T helper effector lineages in vitro.
Het concept van de verschillende geslachten of subsets van CD4 + T-helper (Th) cellen is al sinds de tweede helft van de 20 e eeuw 1 geweest. Erkenning van verwant antigeen in de aanwezigheid van co-stimulerende signalen resulteert in verschillende rondes van cellulaire proliferatie en de uiteindelijke differentiatie naar effector Th cellen. Het type van de cel die tijdens dit proces is afhankelijk van het cytokine milieu aanwezig tijdens activering 2. Aanvankelijk werden naïeve Th-cellen vermoedelijk polariseren in 2 verschillende lineages na T cel receptor (TCR) activatie costimulatoire CD28 ligatie, en cytokine signalering. Type 1 helpercellen (Th1) worden gekenmerkt door hun effector productie van het cytokine IFNy en hun behoefte aan IL-12 signalering tijdens het differentiatieproces 3,4. Uiteindelijk werd ontdekt dat gedifferentieerde Th1 cellen een genetisch profiel meest kenmerkend wordt gekarakteriseerd by de expressie van het T-box familie transcriptiefactor Tbx21 (T-bet), die als de regulering van het Th1 genetische programma 5. Bovendien, IL-12 en IFNy kan bevorderen T-bet-expressie 6,7. In de immuunrespons, Th1 cellen zijn belangrijk voor de afweer tegen intracellulaire pathogenen en sterke promoters van auto-ontsteking. Daarentegen type 2 helper cellen (Th2) vereist IL-4 voor hun ontwikkeling en effector cytokinen, zoals IL-4, IL-5 en IL-13, zijn belangrijk voor het besturen B-cel responsen en pathogeen allergie 8, 9. Vergelijkbaar met Th1-cellen, werden Th2-cellen gevonden om hun eigen meester transcriptionele regulator te uiten, genoemd GATA-3 10,11. Interessant is dat de aanwezigheid van polariserende cytokinen en het genereren van een specifieke Th lijn zijn antagonistisch voor de ontwikkeling van andere 2,12 suggereert dat slechts een bepaald Th subgroep dominant kan worden tijdens een immuunrespons rerespons.
Aangezien de selectie van de Th1 en Th2 lineages, verder werk nog unieker subsets van T-helpercellen, waaronder folliculaire helper (TFH), IL-9-producerende (Th9) en IL-22-producerende (Th22) (onlangs aangetoond beoordeeld in 13). Voor de in vitro differentiatie experimenten dit protocol alleen richten op twee extra Th subsets, zogenaamde regulatoire T-cellen (Treg) en IL-17 producerende CD4 + T-cellen (Th17). CD25 + regulerende T-cellen kan natuurlijk (nTreg) in de thymus voorkomt; naïeve Th-cellen kunnen worden geïnduceerd (iTreg) de regelgeving in de periferie (beoordeeld in 14,15) worden. Beide Tregs drukken een karakteristiek transcriptiefactor, genaamd forkhead box P3 (Foxp3), die essentieel is voor de onderdrukking effector mechanismen oplosbare anti-inflammatoire mediator productie, IL-2 consumptie en cel contact-afhankelijke mechanismen 14,15 omvatten. Het gebrek aan foxp3 de expressie leidt tot een ernstige meerdere organen autoimmuun afwijking genoemd immuun ontregeling, polyendocrinopathy, enteropathie, X-gebonden syndroom (IPEX), waaruit de kritische rol van deze Th subset oplossen ontsteking en reguleren perifere tolerantie voor zelf-antigenen 16. In vitro naïeve CD4 + T-helpercellen up-reguleren Foxp3 en worden toegewijd aan het Treg programma bij stimulatie met IL-2 en TGF-β 14,15. Er kan matig aanzienlijke plasticiteit in CD4 + T-cellijnen zijn vooral voor de bespreking slechts cytokineproductie (beoordeeld in 17,18). Voor de toepassing van in vitro differentiatie protocollen zullen we bespreken elke subset als uniek afstamming.
Onlangs is een subset van Th17 cellen die de IL-17 cytokine productie werd geïdentificeerd als een unieke lijn met pro-inflammatoire functies die bijzonder pathogene auto-inflammatie tijdens 19-21. Th17 cellen brengen een unieke transcriptiefactor, genaamd-retinoid gerelateerde weesreceptor gamma t (RORγt) dat de Th17 genetische programma 22 coördineert. TGFp is belangrijk voor het genereren van Th17 lijn door de inductie van RORγt. Echter, het effect van TGFP signalering aangenomen alleen Th17 engagement induceren bij synergizing met IL-6 (besproken in 12). Verdere studies hebben aangetoond dat een verscheidenheid van andere signalen die positief kan regelen Th17 engagement, waaronder IL-1β, verhoogde natrium- en TLR signalering 23-26. Andere rapporten hebben gesuggereerd dat de pathogene Th17 cellen in vivo zijn degenen die daadwerkelijk omzeilen TGFp signalering en erop te vertrouwen een combinatie van IL-1, IL-6 en IL-23 voor hun differentiatie 27. Aldus kan Th17 cellen afgeleid van een verscheidenheid van signaaltransductiewegen; voor de toepassing van dit protocol, de algemeen gebruikte (TGF en IL-6) route voor Th17 lineage inzetzal worden gepresenteerd.
De differentiatie protocollen hieronder beschreven voor effector lineages voert vaste antilichaam stimuli voor de TCR en CD28 gedurende het gehele verloop van het experiment. Echter, hebben anderen aangetoond dat TCR activering met antigeen presenterende cellen 28 of verknoping anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen met hamster antilichaam gedurende 2 dagen 29 zijn ook zeer effectief middel induceren van de productie van verschillende subsets Th. De hier gepresenteerde protocol gebaseerd op eerder gerapporteerde methoden voor het isoleren van muizen-CD4 + T-cellen van secundaire lymfoïde organen 30 en het genereren Th17 cellen 31. Een belangrijk verschil is dat dit protocol gebaseerd op het gebruik van een cell sorter om naïeve CD4 + T-cellen geïsoleerd uit lymfoïde weefsels. Veel bedrijven bieden nu snelle scheiding kits die kunnen verrijken naïeve CD4 + T-cellen, die in staat zijn om de vereiste f omzeilenof sorteren afhankelijk van het experiment. De methoden en reagentia die in dit protocol zijn wat we routinematig gebruiken en vind het meest effectief te zijn. Echter, in gedachten houden dat alternatieve reagentia en methodologieën bestaan voor veel van de stappen die hieronder gepresenteerd en het is aan de individuele lab om te bepalen wat het beste werkt voor hun doeleinden.
Terwijl de milt bevat naïeve Th-cellen, het aandeel van deze populatie in lymfeklieren veel hoger. Niet lymfeklieren goed te identificeren en verwijderen dit protocol zal resulteren in een slechte opbrengst van naïeve cellen. Dit kan in oudere muizen of mannelijke muizen die meer vetweefsel bijzonder moeilijk. Zoals getoond in figuur 1, stevige bevestiging en pinning van de ledematen en dierlijke huid zal gemakkelijker visualisatie van de buitenzijde toegankelijke lymfeknopen. Zodra lymfeklieren en mi…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag alle leden van de Reynolds lab aan Rosalind Franklin Universiteit van Geneeskunde en Wetenschap, en de Chen Dong lab aan de Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center bedanken voor de optimalisatie van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door een subsidie aan JMR van de National Institutes of Health (K22AI104941).
Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
Cytokines: | |||
Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
Antibodies: | |||
2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |