Souris Naïf CD4⁺ Isolement des cellules T et<em> In vitro</em> Différenciation en sous-ensembles de cellules T

Le concept de lignées ou sous-ensembles de CD4 ⁺ T auxiliaires distinctes (Th) cellules a été autour depuis la dernière partie du 20 ^e siècle ^1. Reconnaissance de l'antigène correspondant à la présence de signaux de co-stimulation dans les résultats de plusieurs cycles de la prolifération cellulaire et la différenciation ultérieure dans les cellules Th effecteur. Le type de cellule Th générée lors de ce processus dépend de l'environnement de cytokines présentes lors de l'activation ^2. Initialement, les cellules Th naïves étaient considérés polariser en deux lignées distinctes suivantes récepteur de cellule T (TCR) d'activation, co-stimulation CD28 ligation et la signalisation des cytokines. 1 des cellules auxiliaires de type Th1 () sont caractérisées par leur production de la cytokine effectrice IFNy ainsi que leur exigence pour l'IL-12 au cours de la signalisation de ^3,4 processus de différenciation. Finalement, il a été découvert que les cellules Th1 différenciées ont un profil génétique qui se caractérise plus distinctement by l'expression de la boîte de T facteur de transcription de la famille, Tbx21 (T-bet), qui est considéré comme le régulateur maître du programme génétique Th1 ^5. En outre, l'IL-12 ainsi que IFN peut favoriser l'expression T-bet ^6,7. Dans la réponse immunitaire, les cellules Th1 sont importants pour la défense de l'hôte contre les pathogènes intracellulaires ainsi que des promoteurs forts de l'inflammation auto-immune. En revanche, les cellules de type 2 auxiliaires (Th2) nécessitent l'IL-4 pour leur développement et leur cytokines effectrices, y compris l'IL-4, IL-5 et IL-13, sont importantes pour entraîner des réponses de lymphocytes B et sont pathogènes dans l'allergie ^{8, 9.} Semblables à des cellules Th1, Th2 ont été trouvés pour exprimer leur propre régulateur maître de transcription, appelé GATA-3 ^10,11. Fait intéressant, la présence de cytokines polarisantes et la génération d'une lignée Th spécifique sont antagonistes à l'élaboration d'autres ^2,12, ce qui suggère que seul un sous-ensemble particulier Th peut devenir dominante au cours d'une re immunitaireréponse.

Depuis l'identification des lignées Th1 et Th2, d'autres travaux ont démontré sous-ensembles encore plus unique de cellules T auxiliaires, y compris folliculaire aide (TFH), IL-9-production (Th9), et IL-22-production (TH22) (récemment en revue dans ^13). Aux fins d'expériences in vitro de différenciation, ce protocole se concentrer uniquement sur ​​deux sous-ensembles Th supplémentaires, appelés cellules T régulatrices (Treg) et les cellules T CD4 ⁺ IL-17-production (Th17). cellules T régulatrices CD25 ⁺ peuvent se produire naturellement (nTreg) dans le thymus; cellules Th naïves peuvent également être induites (iTreg) pour devenir réglementaire dans la périphérie (revue dans ^14,15). Les deux types de Tregs expriment un facteur de transcription caractéristique, appelé boîte forkhead P3 (Foxp3), ce qui est essentiel pour leurs mécanismes de suppression effectrices qui incluent la production soluble anti-inflammatoire médiateur, IL-2 la consommation, et la cellule mécanismes de contact dépendant ^14,15. Le manque de Foxp3 résultats d'expression dans un grave, plusieurs organes trouble auto-immune appelés dysrégulation immunitaire, polyendocrinopathie, entéropathie, le syndrome lié à l'X (IPEX), démontrant le rôle critique de ce sous-ensemble Th dans la résolution de l'inflammation et de réglementer la tolérance périphérique aux antigènes du soi ^16. In vitro, les cellules T helper CD4 ⁺ naïfs jusqu'à régulent Foxp3 et adhérer au programme Treg lors de la stimulation par l'IL-2 et TGF-β ^14,15. Il peut être modérée à la plasticité considérable lignées de cellules T CD4 ^+, en particulier lorsque l'on considère que la production de cytokines (revue dans ^17,18). Toutefois, pour les fins de protocoles in vitro de différenciation, nous allons discuter chaque sous-ensemble comme une lignée unique.

Récemment, un sous-ensemble de cellules Th17 qui produit la cytokine IL-17 a été identifié comme une lignée unique avec des fonctions pro-inflammatoires qui sont particulièrement pathogène pendant une inflammation auto-immune ^19-21. Th17 cellules expriment un facteur de transcription unique appelé liés rétinoïde-récepteur orphelin gamma t (RORγt) qui coordonne le programme génétique ²² Th17. TGFß est important pour la génération de la lignée Th17 par l'induction de RORγt. Cependant, on croit l'effet de la signalisation TGF pour induire seul engagement sur ​​Th17 synergie avec l'IL-6 (revue dans ^12). D'autres études ont montré qu'une variété d'autres signaux qui peuvent réguler positivement l'engagement Th17, y compris l'IL-1β, l'augmentation de sodium et de signalisation TLR ^23-26. D'autres rapports ont suggéré que les cellules Th17 pathogènes in vivo sont ceux qui contournent effectivement signalisation TGFß et se appuient sur ​​une combinaison de IL-1, IL-6, IL-23 et de ²⁷ leur différenciation. Ainsi, les cellules Th17 peuvent être dérivées d'une variété de voies de signalisation; aux fins de ce protocole, l'couramment utilisé (TGFß et de l'IL-6) voie d'un engagement de la lignée Th17sera présenté.

Les protocoles décrits ci-dessous de différenciation pour toutes les lignées effectrices repose sur l'anticorps fixe comme stimuli pour le TCR et CD28 pendant toute la durée de l'expérience. Cependant, d'autres ont démontré que l'activation du TCR avec des cellules présentatrices d'antigène ²⁸ ou de reticulation anti-CD3 et anti-CD28 avec un anticorps de hamster pendant 2 jours ²⁹ sont également des moyens très efficaces pour induire la production de divers sous-ensembles Th. Le protocole présenté ici se appuie sur les méthodes précédemment rapportées pour isoler des cellules T CD4 ⁺ murines des organes lymphoïdes secondaires ³⁰ et générer des cellules Th17 ^31. Une différence majeure est que ce protocole repose sur l'utilisation d'un trieur de cellules pour isoler les cellules T CD4 ⁺ naïfs provenant de tissus lymphoïdes. Cependant, de nombreuses entreprises offrent maintenant des kits de séparation rapides qui peuvent enrichir des cellules naïves T CD4 ^+, qui peuvent être en mesure de contourner l'exigence fou le tri en fonction de l'expérience. Les méthodes et les réactifs présentés dans ce protocole sont ce que nous utilisons régulièrement et de trouver pour être le plus efficace. Cependant, gardez à l'esprit que les réactifs et les méthodes alternatives existent pour la plupart des étapes présentées ci-dessous et ce est au laboratoire individu de déterminer ce qui fonctionnera le mieux pour leurs fins.