A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.
在突触前靶向梭菌神经毒素(碳纳米管)的治疗和机理研究已经由需要产生正常突触和经历生理反应中毒可扩展的,基于细胞的模型的限制。在这里,我们描述一个简单的和可靠的方法,以有效地分化的鼠胚胎干细胞(ESCs)到突触活性,网络的神经元定义谱系。以下内容的8天分化方案,小鼠胚胎干细胞衍生的神经元(ESN信息)快速表达和划分neurotypic蛋白质,形成神经元的形态和发展的内在电响应。由分化后的18天(DIV 18),ESN信息显示出活性的谷氨酸和γ氨基丁酸(GABA)GABA能突触和特征是兴奋性紧急网络行为:抑制平衡。为了确定中毒碳纳米管是否功能拮抗突触神经传递,从而复制次E 在体内的病理生理,它负责肉毒中毒或破伤风的临床表现,全细胞膜片钳电被用来量化自发微小兴奋性突触后电流(mEPSCs)在暴露于破伤风神经毒素(帐幕)或肉毒毒素ESN信息(的BoNT)血清型/ A- / G。在所有的情况下,表现出ESN信息内20小时突触活动的近乎完全丧失。陶醉的神经元仍然可行,具体表现为静止不变的膜电位和内在的电反应。这种方法的灵敏度进一步表征,中毒突触活性的剂量依赖性影响,测定另外的BoNT / A的后20小时。中毒与0.005时肉毒毒素/ A导致了mEPSCs一个显著递减,与0.013时的中位数抑制浓度(IC 50)。平均剂量的比较表明,抑制突触功能的测量速度更快,更具体,比SNARE更敏感裂解测定法或鼠标致死测定。这些数据验证了使用突触耦合,干细胞衍生的神经元为CNT的高特异性和灵敏的检测。
该方法的总的目标是在功能上评估突触活动中暴露于梭菌神经毒素的干细胞衍生的神经元网络培养物。这是一种在体外派生模型,功能复制负责肉毒中毒的临床表现的病理生理学和验证一个ESN作为一个合适的模型检测碳纳米管,治疗的筛选和机理研究的第一个示范。
BoNTs是由梭菌属的成员产生高致命性细菌的神经毒素。包括最近提出的BoNT / H,8抗原性不同的BoNT血清型已经描述(/ A / H)1,2。所有血清型被表达为150 kDa的肽是翻译后缺口,以产生一个100kDa的重链(HC)构成迪辰和一个50kDa的轻链(LC)通过二硫键3相连。慧聪介导结合突触前受体和耳鼻喉科RY毒素进入突触通过内吞作用的神经元。期间内体处理,所述HC经历结构重新组织,以在小泡膜的孔,便于LC的易位进入突触前细胞溶胶。该LC然后专门针对和突触前车厢切割可溶性ñ-ethylmaleimide敏感融合附着蛋白受体(SNARE)蛋白质:SNAP-25(肉毒毒素/ A,/ C,/ E),VAMP2(肉毒毒素/ B,/ D, /楼/ G)或突触(肉毒毒素/ C)1。任何这些SNARE蛋白的裂解防止突触胞吐机制的组件,从而阻断神经递质释放。有效的神经元定位和突触前定位的这种组合使得BoNTs最有效的毒药已知,估计人类致死剂量低至0.1 – 1纳克/千克1。
生化测定法可用于检测的CNT LC的具有高灵敏度的存在或活性。然而,这些方法不能我nterrogate结合,输入毒素的能力,激活和神经元内的功能,并且因此是活性的毒素的存在的间接和可能误导的措施。与此相反,中毒的功能测定,例如在小鼠致死性试验(MLA)综合评价CNT的成功协商摄取和激活的所有阶段的能力,提供了毒素活性的更相关的和具体的评估。而MLA是肉毒毒素检测的黄金标准,它是一种使用死亡作为终点的体内方法,因此具有有限的效用的研究平台。尝试开发适合机理研究和治疗筛查CNT中毒的细胞为基础的车型也遭遇显著的局限性。而初级神经元培养提供生理相关程度高,它们的使用是由许多因素复杂,包括高资源成本,相对低的产率,对多个神经子的存在类型和涉及动物使用广泛的监管和行政监督。作为替代原代神经元,神经细胞系(其可以被诱导以采用由化学刺激神经 元样性质),如神经母细胞瘤和肾上腺嗜铬细胞已被用作体外模型中毒。因为这些细胞继续培养诱导之前,它们是高度可扩展的,因此,非常适合于中等通量的方法。然而,他们的相关性是有问题的,因为诱导的表型通常是异质的,都是不良敏感CNT和不能显示出临界神经行为,包括无法以形成组装成正常突触4前和突触后车厢。在没有生理上的完整突触前车厢,全系列的毒素:神经元相互作用不能被复制和中毒,因此功能性测试是不可能的5。没有吨奇怪的是,尝试进行了成果是在体内和初级神经元的研究6不一致的机理研究和药物筛选使用引起的神经细胞系BoNTs。
已经提出了干细胞衍生的中枢神经系统(CNS)中的神经元可提供下一代基于细胞的平台的BoNT研究相结合的原代神经元的关联性与培养的细胞系7-10的灵活性。具体地,小鼠的干细胞衍生的神经元(ESN信息)已被发现是向生理剂量的BoNT / A- / G高度敏感和复制许多体内反应中毒,包括差动不放过,活性增强的中毒,和血清型特异性效力5,8,11。这些行为表明,肉毒毒素的吸收,加工,贩运和活动的体内机制是保守的ESN信息。然而,抑制突触activit的y是肉毒中毒的署名表现,并得出结论认为ESN信息是一个合适的体外衍生的细胞系模型的CNT研究之前因此由碳纳米管表明突触活动的下列中毒损失是必不可少的。
为了测量中毒与突触活动碳纳米管的影响,全细胞膜片钳电生理学来定量在媒介物处理的CNT或处理DIV 21 + ESN信息突触电流。我们发现一个ESN与肉毒毒素/ A- / G或帐篷是中毒引起的范围内20小时在所有情况下的突触活动> 95%的损失。进一步表征进行中毒后20小时用的BoNT / A表明对突触活性的剂量依赖性作用,具有检测低于0.005 PM期限及0.013 PM的IC 50值。这些结果表明,电生理检测中毒的灵敏度和时间帧都大大超过可比免疫系ANA改进的SNAP-25裂解和体内小鼠致死性测定裂解,证明中毒的突触活性的神经元培养物的功能测量可以便于更灵敏,特异和快速的方法来对的BoNT的细胞应答表征。
目前的黄金标准CNT检测,血清型的决心和定量的工作重点。所述MLA询问主机的整个范围:基板所需中毒发生在体内毒素相互作用( 例如,毒素结合于细胞表面受体,该毒素-受体复合物,LC易位到细胞质的内化,液相色谱-介导的裂解和抑制突触神经传递)18。然而,虽然提供了MLA中毒的生理相关模型,它是资源密集型的,可以通过污染物被混淆,并涉及大量的小鼠的死亡作为终点。可替代地,基于细胞的测定法的BoNT检测和定量被限制在初级神经元培养物,这也需要使用动物,或神经母细胞瘤的细胞系,这不能形成突触和通常表现出敏感性差向神经毒素8。迄今为止,最次中毒测量ESE细胞为基础的平台上都依赖于检测SNAP-25,VAMP1 / 2或突触-1 11的蛋白裂解的。这是有问题的,因为SNARE蛋白切割位已被证明是非线性与突触抑制体内相关,因此可能无法准确地表示中毒或恢复从中毒19,20。
对于CNT检测一个理想的基于细胞的模型系统将(ⅰ)是神经系; (二)被突触加上neurotypic电反应; (三)对于所有CNT血清型或亚型高度敏感;及(iv)提供可扩展性,吞吐量和测定倍相当于或改良过的工作重点,以较低的成本,并且不需要使用动物。为了满足这些要求,我们开发了一种方法,从市售的鼠标ESC线产生大量高浓缩铀,网络谷氨酸的文化和GABA能神经元。然后,我们开发了MIST试验量化突触抑制响应中毒与帐篷,肉毒毒素/ A- / G。而MIST试验可以在任何突触神经元活动的人群( 如初级神经元或脑切片)进行,目前ESN信息是唯一的体外派生神经元模型的重复性开发新兴的网络行为,因此适合于MIST检测。
生产足够量的定义沿袭CNT研究神经元需要一些创新的ESC文化和分化。首先,通过选择和培养的胚胎干细胞,可以存活悬浮适应,我们消除了由饲养细胞,以及需要从胚胎干细胞纯化饲养细胞在分化的起始污染的可能性。虽然底层悬浮适应的分子机制尚不清楚,悬浮适应的胚胎干细胞保持有丝分裂活跃,保留的Oct3 / 4的表达,并继续成为神经。使用这种方法,〜1.5×10 7] E旺通常恢复每个通道。二,生产的NPC通过掺入机械搅拌以防止分化过程中结块,表面上是增加养分无障碍聚集体的内部升高〜300%。在这个过程中,我们发现,用于ESC培养和神经元分化的血清是在维持胚胎干细胞源性的最关键部件。为了达到最佳的成功,我们建议悬浮适应的ES细胞向每批血清和储存血清在-20℃下通过到期日期,以支持ESC培养和神经元分化。
如同大多数突触活性培养物,DIV 14 + ESN信息极易受到pH的突然变化,甚至短暂暴露于大气中的CO 2浓度可导致神经毒性在24小时内。对于需要治疗的文化其次是孵化持久的O / N或更长的时间,神经元必须直接处理的实验我n中的孵化或转移至前实验的恒定的 CO 2室中。
多种技术确认神经和神经元的成熟,包括ICC,转录谱和全细胞膜片钳电。在基因表达和神经元形态学的时间变化是通过神经发生的发育阶段迅速进展一致,并且由格16,ESN信息表现兴奋和抑制微型突触后电流与紧急网络行为16。突触活动的证据表明,ESN信息可能会复制负责肉毒中毒和破伤风的临床表现的病理生理学。这是通过使用MIST证明中毒用的BoNT / A- / G或相比于载体处理的或未经处理的神经元的TeNT受损mEPSC频率由> 95%的确认。
薄雾的BoNT / A的灵敏度的测量所指示的半数抑制浓度(IC 50)为0.013 PM(相当于0.5小鼠致死单位/ ml)和低于0.005 PM一个极限的检测,测定浴后加入20小时。基于这些值,雾大约两倍敏感和2 – 比MLA快4倍和30倍,比免疫系检测裂解SNAP-25的更敏感。
总的来说,这些数据表明,干细胞衍生的神经元网络的人群提供中毒的生理上相关的,基于细胞的模型。在具有改进的方法从悬浮液适于胚胎干细胞衍生的网络的ESN文化组合,利用雾的应减少需要进行动物试验和相关的缺点,费用和MLA的伦理问题,同时提供更迅速,敏感和特异的措施中毒。虽然全细胞膜片钳电是低通量的方法用于鉴定活性的神经毒素的存在下,它提供了一个分辨率和SPEED采用分子生物学方法是无法实现的。这些研究结果还提供了证据,证明活性依赖性方法的应用,以评估突触活动和网络行为可使得快速和特异性检测的神经毒素。这种较高通量的方法将使机理研究,治疗的筛选或诊断测定法的神经调节剂,包括碳纳米管各种各样可行的。
The authors have nothing to disclose.
这个工作是由过敏的国立卫生与传染病研究所(IAA数量AOD12058-0001-0000)和国防威胁降低局的国家机构 – 联合科技厅,医疗科技事业部(金人数CBM.THRTOX.01.10 .RC.023和CBM.THRTOX.01.RC.014)。这项研究进行,而PB举行的国防威胁降低局,美国国家研究委员会的研究会士奖和KH召开全国研究委员会研究会士奖。我们感谢安吉拉·阿德金斯和空间Kaylie Tuznik(USAMRICD)的技术援助;和Cindy Kronman(USAMRICD)的编辑协助。本文所表达的意见是作者的,并不反映陆军部,国防部,或美国政府的官方政策。
Table 1. ESC and ESN | ||||
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
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100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
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200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL | |
ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL | |
55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL | |
107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
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100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
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200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL | |
ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL | |
Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
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0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
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Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg | |
Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
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Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
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Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 | |
DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
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100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
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100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
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50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
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200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
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Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | ||
TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
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DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT | |
soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C | |
ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT | |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. | |
retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. | |
Table 2. MIST | ||||
NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
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KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
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NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
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CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
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MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
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D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
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HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
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K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
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NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
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Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
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Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
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CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
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MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
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EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 380.35 MW: 1 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
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bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
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CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
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Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
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BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
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Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
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Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
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Table 3. Equipment and Software | ||||
MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software | |
Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings | |
Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software | |
Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | ||
micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | ||
patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | ||
micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | ||
borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 | |
18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | ||
plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | ||
cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | ||
Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | ||
low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 | |
bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |