Kök ve Ağ Kültürlerde Biyolojik nörotoksinlerin Fonksiyonel Değerlendirme Merkezi Sinir Sistemi Nöronlar Hücre-türetilmiş

EKH 1. Adaptasyon Hücre-serbest Süspansiyon Kültürü Besleyici için 37 ° C'de çözülme EKH buz şerit kalana kadar. 10 6, önceden ısıtılmış ESC ortamı 10 ml su ihtiva eden bir sigara doku kültürü ile muamele edilmiş çanak EKH ayrışmış x 2.5 – P1000 pipeti kullanarak, yavaşça 1 aktarın. 37 ° C'de 20 saat% 5 CO2 için nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörü içinde inkübe edilir. 20 saat sonra, yavaşça 10 ml serolojik pipet kullanarak 15 ml konik tüp süspansiyon kültürü aktararak hücreleri yıkayın. 200 x g'de 3 dakika boyunca Pelet ESCs. Spin sırasında, düşük-yapışma çanak geri taze ESC orta 10 ml ekleyin. Süpernatant aspire, özen hücre pelet yerinden oynatmamaya önlemek ve 1 ml pelet hücre taze ESC orta ekleyin. P1000 pipet kullanarak bakteriyel çanak hücreleri aktarın ve inkübatör dönmek. Agrega çıplak gözle (genellikle 4 görünür hale gelene kadar günlük hücreleri uyun – 8 gün (d); agrega 0.2 olacak- 0,5 mm). Agrega 4 d sonra belirgin değilse, adım 1.3 tekrarlayın. Agregalar görebilir sonra, ayırmak ve Bölüm 2'de tarif edildiği gibi EKH korur. 2. ESC Pasajlanması ve Bakım ESC 15 ml steril 10 ml'lik pipet kullanarak konik tüp agrega aktarın ve agrega kompakt pelet yerleşmek için izin (genellikle 3-5 dakika). Süpernatant aspire dikkat ederek hücre pelletini bozmamak ve 5 ml PBS ile agrega yıkayın. Yerçekimi dinlendirme 2.5 dakika boyunca 100 xg'de, alternatif pelet hücreleri tavsiye edilir rağmen yerine zaman kazanmak için. PBS aspire ve 500 ul tripsin ekleyin. 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde, 3 dakika süre ile tripsine yığışmalar inkübe edin. Tripsin sulandırmak ve yavaşça agrega kırmak için P1000 pipet ile 10 kez çiğnemek için 500 ul ESC orta ekleyin. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Pelet 1.0 bir son konsantrasyona kadar, 200 x g ve tekrar süspansiyon hücreleri 3 dakika boyunca hücreler ayrışmışESC ortamında x 10 7 hücre / ml olmuştur. Aktarım 150 10 cm'lik bir bakteri tabağına taze ESC ortamı 10 ml ul (1.5 x 10 6 hücre) ve 48 saat doku kültürü kuluçka makinesine geri döner. % 10 DMSO, veya atılır ile takviye edilmiş% 90 ESC ortamda 5 x 10 6 hücre / mL – Aşırı EKH 1 ile dondurulan, ayırt edilebilir. Passage her 48 saat toplar. Geçişi için hazır Agregalar 0,5 mm'den çapları, açıkça görünür olacaktır. NOT: – 1.4 dondurulan, süspansiyon-adapte hücrelerin Çözülme ve kültür adımları 1.2 başına gerçekleştirilir. 72 saat – Agregalar 48 içinde pasaj için hazır olacak. 3. Nöronal Farklılaşma NOT: – öğleden sonra önce öğle 3.5 ve 3.7 adıma Davranış 3.1 adımları. Farklılaşma prosedürlerinin bir görünümü, Şekil 1A'da gösterilmiştir. 2.5 – 2.1 adımda olduğu gibi EKH ayrıştırmaları. Disosiye Devri 350 ul (3.5 x 10 6)25 ml farklılaşma ortamı içeren bir 10 cm'lik düşük bağlanma çanak d EKH. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de, bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 45 rpm'de – 30 olarak ayarlanmış bir yörüngesel çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Bu farklılaşma ilk günü, in vitro (DIV) içinde adlandırılan gün -8. NOT: ultra-düşük bağlanma çanak kullanımı yönteminin maliyetini artırır, ancak agrega bazen Petri kapları uymak beri bakteriyel Petri kapları biraz daha büyük verim üretir. Farklı çanak boyutları tercih edilir ise, orta hacimleri ve hücre numaraları buna göre ölçeklendirilebilir. 48 saat (DIV -6) eklendikten sonra, 50 ml konik bir tüp ayırt hücre agrega aktarmak için 25 ml'lik bir pipet kullanın. Hemen Petri kabı farklılaştırma ortamının taze 25 ml ekleyin. 2 mm derinliğinde – 1 görünür pelet üretiminde, 5 dakika – agrega üzerinde 2 yerleşmek için izin verin. Süspansiyon kalan tek hücreler veya küçük agrega geçiyoruz. Dikkatle orta aspire ve ce transferill geri P1000 kullanılarak petri pelet. Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde, döner bir karıştırıcı üzerine yerleştirin. DIV -4 tekrar adım 3.2. 4 mm derinliğinde – pelet 2 olacaktır. Petri 6 uM all-trans retinoik asit (RA) ile takviye edilmiş 30 ml farklılaşma orta değiştirin. Ek bir 48 saat boyunca doku kültür inkübatörü içinde, döner bir karıştırıcı geri dönün. DIV -2 tekrar adım 3.3 at. Bu noktada derin 8 mm – pelet 4 olacak. DIV -1 anda, Bölüm 4 gibi kaplama yüzeyler hazırlamak. Bir doku kültürü kaputu 10 dakika ve yeri – DIV 0 durumunda, 5 37 ° C'de numune alınır ve önceden dondurulmuş NPC tripsinizasyon ortamın 5 ml eritin. Transfer, bir 50 ml konik bir tüp agrega farklılaştırılması, 25 ml'lik bir pipet kullanılarak. Agrega yerleşmek ve dikkatle aspire orta izin ver. Yıkama agrega yıkamalar arasında yerleşmeye izin 10 mi, PBS ile iki kez pelet. İkinci PBS Yıkama işleminden sonra, pelet NPC tripsinizasyon ortamın 5 ml ilave edilir ve 37 ° C'de inkübe6, 5 dakika bekletilmiştir. Yavaşça 2.5 dakika sonra tüp fiske. Tripsin inaktive ve alt üst edilerek karıştırmak için,% 0.1 soya fasulyesi tripsin inhibitörü (STI) 5 ml. Nispeten homojen hücre süspansiyonu elde edilene kadar 10 ml serolojik pipet ile 15 kez – Yavaşça 10 çiğnemek. Yavaş yavaş 50 ml konik tüp üst yerleştirilen 40 mikron ya da 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu aktarın. Tüm süspansiyon filtre edildikten sonra, filtre içinden kalan hücrelerin yıkanması ve 200 x g hızında 6 dakika boyunca ayrışmış hücre süspansiyonu topak haline N2 ortamı içinde 1 ml. Pelet bozmadan orta aspire. 200 x g'de 5 dakika boyunca hücreler peletleme ve P1000 ile yıkamalar arasında öğütülerek, 10 mi N2 ortamı hücreler iki kez yıkanır. İkinci yıkama öncesinde, Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. / Cm2 200.000 hücre – 150.000 hücre yoğunluğunda mi ve plaka ESNs başına 1 x 10 7 hücre N2 ortamında yeniden süspanse hücreleri. Yeni plat Transferinemlendirilmiş bir 37 ° C 'de doku kültürü kuluçka% 5 CO2 ile baskı ESNs ve Bölüm 5'te olduğu gibi muhafaza. DIV 0 Kaplama Sinir Öncülerinin Kültür Yüzeyler hazırlanması 4. Kaplama en az 1 gün önce doku kültürü ile tedavi yemekler hazırlayın. (PEI, steril H2O içinde 25 ug / ml) yeterli polietilenimin ekleme veya poli-D-lisin (PDL, 100 ug / ml steril H2O içinde) O / N plastik tabaklar doku kültürü ile muamele edilmiş kapak ve kuluçkalanması 37 ° C. Kaplama sabah, iki kez damıtılmış H2O ile iki kez bulaşık yıkamak ve bir kez PBS ile yıkanmıştır. Son yıkamadan sonra, çanak karşılamak için yeterli N2 orta ekleyin (örneğin, bir 12-yuvalı tabak oyuk başına 1 ml ya da 6 cm'lik tabağı başına 4 ml) eklenmiştir. En az bir gün önce nöron kaplama 18 mm cam lamelleri hazırlayın. Plazmanın temizleme 4 dakika temizleyin lamelleri. Derhal bir alt, bir etanol ile yıkanmış parafilm temizlenmiş lamelleri aktarmakBüyük steril çanak ve adım 4.1 gibi hazırlanmış PEI veya PDL çözeltisi 400 ul ekleyin. Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de O / N inkübe edin. Sabah, yıkama suyu ile üç kez lamelleri 1 PBS içinde 5 ug / ml laminin eklemek – 37 ° C de 3 saat süredir. Önceki nöronlar dissociating için, laminin aspire ve hemen yukarı bakacak tedavi tarafı tutmak için emin olmak NPC orta 1 ml içeren bir 12-iyi bir çanak bir kuyusuna lamel aktarın. Mağaza yemekleri ve 37 ° C'de lamelleri NPC plaka hazır olana kadar. Nöronlar 5. Bakım Ve DIV 1, aspirat ortamı en N2 kültür ortamı ile değiştirin. Ve DIV 2 ve 4, aspirat ortamı içinde B27 kültür ortamı ile değiştirin. DIV 8, aspirat orta ve B27 kültür ortamı ihtiva eden mitotik inhibitörler ile değiştirin ve nöronal-olmayan hücreleri kirlenmesine neden ortadan kaldırmak için. DIV 12 at, B27 kültür ortamı ile değiştirin. DIV çıkarmayınHazır olana kadar% 5 CO2 den 12 + ESNs kullanımı. Minyatür Uyarıcı Post-sinaptik Akımları miktarının için Sinaptik İletim (MIST) Tahlil 6. Ölçülen engellenmesi DİKKAT: – 1 ng / kg Klostridial nörotoksinler 0.1 gibi düşük bir tahmini insan LD 50 değerleri ile bilinen en zehirli maddelerdir. Bu toksinler kullanarak ve uygun önlemleri kullanmadan önce gerekli onayları almak. Dikkatlice 37 ° C için arzu edilen nihai ESN kültür ortamında konsantrasyonu ve sıcak 100x, BoNT / A seyreltin. 21 + ESN kültürleri div kültür çanak girdap ve inkübatör dönmek için toksinin uygun hacmi ekleyin. Hücreler zehirlenmeden sonraki en fazla 4 saat analiz edilecek olursa, bu direkt olarak bir inkübatör içinde veya sürekli bir CO2 odası içinde,% 5 CO2 sökmeden çanağı ve girdap toksini ekleyin. Uygun zaman noktasında aspirasyonte ESN kültür ortamı ve hücre dışı kayıt tamponu (ERB) ile iki kez yıkanır. ERB ekleyin 4 ml, sırasıyla, aksiyon potansiyelleri engelleme ve GABA A reseptör aktivitesini antagonize, 5.0 uM tetrodotoxin ve 10 mcM bicuculline ile desteklenmiş. Elektrofizyoloji teçhizat çanak aktarın. Ne perfüzyon veya sıcaklık kontrol MIST deneyi için gereklidir. Direnç 5-10 mΩ ile kayıt pipet üretmek ve hücre içi kayıt tamponu ile doldurmak için bir mikropipet çektirmenin kullanarak borosilikat cam çekin. Yavaşça önce kayıt reaktif silikonlama doldurulan kayıt pipet batırın. Kayıt pipet ERB içine indirilmiş olduğu gibi, bir hava dolu şırınga kullanarak, pozitif basınç sağlar. Nazikçe kaydedilecek nöronun soma kayıt pipet indikten sonra, pozitif basınç kaldırmak ve bir gigaseal oluştururlar. MV -70 tutma gerilimi azaltın. Dikkatle tam hücreli konfigürasyonuna girmeye negatif basınç uygulayın. Izlemek ve membran potansiyeli istirahat kaydetmek için akım-kelepçe geçin. Sıvı değme potansiyelleri için düzeltme olmadan, istirahat membran potansiyeli -82 kadar -67 arasında mV olacaktır. Minyatür uyarıcı sinaptik akımları (mEPSCs) tespit etmek için 5 dakika – 4 için bir sürekli -70 mV voltaj-kelepçe kayıtları yapın. Aşağıdaki ayarlarla başak algılama yazılımını kullanarak mEPSC tespiti için kaydedilen verilerin 4 dakika analiz: Eşik, 5; Dönem yerel maksimum aramak için, 10.000 mikro saniye; Başlangıçta bir tepe önce saat, 5000 mikro-saniye; Dönem sönme süresi aramak için, 20.000 mikro saniye; Zirve Kesir, 0,37, bir çürüme zaman bulmak için; Dönem bir temel ortalama için, 1,000 mikro saniye; Alan eşiği, 20; Ortalama zirve, 1 puan sayısı; Zirve yönü, negatif. Toplayın ve tespit edilen olaylar hakkında bilgi kaydetmek. Hz mEPSC sıklığını belirlemek için 240 ile 4 dakika içinde tespit olayların sayısını bölün. 12 cont – 8 mEPSC frekansları toplayınRols 8 – Her bir maruz kalma durumu 12 BoNT ile tedavi edilen örnekleri. Yaşa ve çok uyumlu kontrollere karşı frekans analiz. Tek yönlü ANOVA testi ve Dunnett post-hoc testi ile sinaptik aktivitenin% inhibisyon istatistiksel olarak anlamlı belirler.