A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.
تم الدراسات العلاجية والآلية للأعصاب المطثية المستهدفة presynaptically (الأنابيب النانوية الكربونية) محدودة بسبب الحاجة إلى وجود نموذج قائم على خلية قابلة للأن تنتج نقاط الاشتباك العصبي عاملة ويخضع الاستجابات الفسيولوجية للتسمم. نحن هنا وصف طريقة بسيطة وقوية للتمييز كفاءة خلايا الفئران الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) في الأنساب محددة من النشطة synaptically، الخلايا العصبية المتصلة بالشبكة. بعد بروتوكول التمايز 8 يوم، الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (ESNs) بسرعة تعبير عن وتجزئة البروتينات neurotypic، تشكل الأشكال التضاريسية العصبية وتطوير الاستجابات الكهربائية الجوهرية. قبل 18 يوما بعد التمايز (DIV 18)، ESNs يحمل glutamatergic نشط وγ الغاما حمض (GABA) نقاط الاشتباك العصبي ergic والسلوكيات شبكة الناشئة التي تتميز مثير: التوازن المثبطة. لتحديد ما إذا كان التسمم مع الأنابيب النانوية الكربونية يعادى وظيفيا متشابك العصبي، وبالتالي تكرار عشره في الجسم الحي الفيزيولوجيا المرضية هي المسؤولة عن المظاهر السريرية للتسمم أو مرض الكزاز، تم استخدام خلية كاملة المشبك التصحيح الكهربية لقياس التيارات عفوية مصغرة مثير آخر متشابك (mEPSCs) في ESNs تتعرض لعصبي الكزاز (خيمة) أو عصبي البوتولينوم (بونت) الأنماط المصلية / A- / G. في جميع الحالات، عرضت ESNs فقدان شبه كاملة من النشاط متشابك في غضون 20 ساعة. وظلت الخلايا العصبية مخمورا قابلة للحياة، كما يتبين من دون تغيير إمكانات غشاء يستريح والاستجابات الكهربائية الجوهرية. لمزيد من تميز حساسية هذا النهج، تم قياس الآثار التي تعتمد على جرعة من السكر على النشاط متشابك 20 ساعة بعد إضافة بونت / A. أدى التسمم مع 0.005 PM بونت / A في إنقاص كبير في mEPSCs، مع تركيز مثبط متوسط (IC 50) من 0.013 PM. مقارنات بين جرعات متوسط تشير إلى أن القياسات الوظيفية لتثبيط متشابك هي أسرع وأكثر تحديدا وأكثر حساسية من كمينالمقايسات الانقسام أو مقايسة الماوس الفتك. هذه البيانات التحقق من صحة استخدام جانب synaptically، الجذعية المشتقة من الخلايا العصبية خلية للكشف محددة للغاية وحساسة من الأنابيب النانوية الكربونية.
ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو تقييم وظيفيا النشاط متشابك في الثقافات شبكات الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية تتعرض لأعصاب المطثية. وهذا هو أول مظاهرة من نموذج مستمد في المختبر أن يعيد ظيفيا pathophysiologies المسؤولة عن المظاهر السريرية للالتسمم الغذائي ويؤكد ESNs كنموذج مناسبة للكشف عن الأنابيب النانوية الكربونية، وفحص العلاجي والدراسات الميكانيكية.
BoNTs للأعصاب البكتيرية القاتلة للغاية التي تنتجها أعضاء المطثيات. بما في ذلك اقترح مؤخرا بونت / H، وقد وصفت ثمانية أنماط مصلية بونت متميزة مستضديا (/ A- / H) 1،2. يتم التعبير عن كل الأنماط المصلية إلى 150 كيلو دالتون الببتيدات التي هي في مرحلة ما بعد translationally رصدت لإنتاج dichain تتكون من 100 كيلو دالتون السلسلة الثقيلة (HC) و 50 كيلو دالتون ضوء سلسلة (LC) ويربطها به السندات ثاني كبريتيد 3. وHC يتوسط ملزم لمستقبلات قبل المشبكي والأنف والحنجرةراي من السم في الخلايا العصبية عن طريق الإلتقام متشابك. أثناء معالجة endosomal، وHC يخضع الهيكلية إعادة تنظيم لتشكيل المسام في الغشاء حويصلة، وتسهيل النبات من LC في العصارة الخلوية قبل المشبكي. وLC ثم يستهدف تحديدا ويشق للذوبان N-حساسة -ethylmaleimide الانصهار مرفق البروتين مستقبلات (كمين) البروتينات في المقصورة قبل المشبكي: SNAP-25 (بونت / A، / C، / E)، VAMP2 (بونت / B، / D، / F، / G) أو syntaxin (بونت / C) 1. انشقاق أي من هذه البروتينات كمين يمنع الجمعية من الآلات إيماس متشابك، وبالتالي عرقلة الافراج عن الناقلات العصبية. هذا المزيج من استهداف الخلايا العصبية كفاءة وتوطين قبل المشبكي يجعل BoNTs السموم أقوى معروفة، بجرعات قاتلة الإنسان المقدرة منخفضة تصل إلى 0،1-1 نانوغرام / كغ 1.
فحوصات الكيمياء الحيوية يمكن استخدامها للكشف عن وجود أو نشاط CNT خطابات الاعتماد مع حساسية عالية. ومع ذلك، فشلت هذه الأساليب إلى interrogate قدرة السم لربط، أدخل، وتفعيل وظيفة داخل الخلايا العصبية، وبالتالي هي التدابير غير المباشرة وربما مضللة من وجود السم النشط. في المقابل، المقايسات الفنية للتسمم مثل فحص الماوس الفتك (MLA) تقييم شامل لقدرة الأنابيب النانوية الكربونية للتفاوض جميع مراحل امتصاص وتفعيل بنجاح، وتوفير تقييمات أكثر ذات الصلة ومحددة من النشاط السم. في حين أن MLA هو الذهب مستوى الكشف بونت، وهو الأسلوب في الجسم الحي الذي يستخدم الموت باعتبارها نقطة نهاية وبالتالي لديه فائدة محدودة كمنصة البحث. لقد عانى محاولات لتطوير النماذج القائمة على خلية من CNT التسمم مناسبة للدراسات الميكانيكية والفحص العلاجي أيضا قيودا كبيرة. في حين الثقافات الخلايا العصبية الأولية توفر درجة عالية من الأهمية الفسيولوجية، معقد استخدامها من قبل عدد من العوامل، بما في ذلك تكاليف الموارد عالية، والعائد المنخفض نسبيا، وجود عدة الفرعية العصبيةأنواع والرقابة التنظيمية والإدارية واسعة تشارك مع استخدام الحيواني. كبديل للالخلايا العصبية الأولية، استخدمت خطوط الخلايا العصبية (التي يمكن أن يتسبب في اعتماد العصبية التي تشبه الخلايا الخصائص التي كتبها التحفيز الكيميائي) مثل neuroblastomas والخلايا أليفة الكروم الكظرية كنماذج في المختبر من التسمم. وبما أن هذه الخلايا هي مثقف بشكل مستمر قبل الاستقراء، فهي تدرجية عالية، وبالتالي مناسبة تماما للنهج المعتدل الإنتاجية. ومع ذلك، أهميتها مشكوك منذ الظواهر التي يسببها غير متجانسة عادة، هي سيئة حساسة لتشارك المركز الوطني وتفشل في معرض السلوكيات العصبية الحرجة، بما في ذلك عدم القدرة على تشكيل المقصورات قبل وبعد متشابك أن التجمع في نقاط الاشتباك العصبي يعمل 4. في غياب المقصورات قبل المشبكي سليمة من الناحية الفسيولوجية، ومجموعة كاملة من السم: التفاعلات العصبية لا يمكن تكرارها والقياسات وبالتالي الوظيفية للتسمم وليس من الممكن 5. لار من المستغرب، ومحاولات لإجراء دراسات الآلية أو فحص المخدرات للBoNTs باستخدام خطوط الخلايا العصبية التي يسببها أسفرت عن النتائج التي تتعارض مع في الجسم الحي والدراسات الخلايا العصبية الابتدائية 6.
وقد اقترح التي تنبع قد توفر الجهاز العصبي المركزي (CNS) الخلايا العصبية المشتقة من خلية منصة تستند خلية الجيل المقبل للبحث بونت الذي يجمع بين أهمية الخلايا العصبية الأولية مع مرونة خطوط خلايا مستنبتة 7-10. على وجه الخصوص، تم العثور على الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية الماوس (ESNs) أن تكون حساسة للغاية لجرعات الفسيولوجية للبونت / A- / G وتكرار كثير في استجابات الجسم الحي إلى التسمم، بما في ذلك persistences التفاضلي، محسنة النشاط التسمم، والنمط المصلي potencies -specific 5،8،11. وتشير هذه السلوكيات التي في آليات الجسم الحي من بونت امتصاص وتجهيز والاتجار والنشاط يتم حفظها في ESNs. ومع ذلك، وتثبيط النشاط. متشابكذ هو مظهر من مظاهر توقيع التسمم الغذائي، وبالتالي يدل على فقدان النشاط متشابك التالية التسمم عن طريق الأنابيب النانوية الكربونية من الضروري قبل الختامية التي ESNs هي مناسبة في اشتقاق نموذج قائم على خلية المختبر للدراسات CNT.
لقياس آثار التسمم مع الأنابيب النانوية الكربونية على النشاط متشابك، تم استخدام خلية كاملة التصحيح، المشبك الكهربية لقياس التيارات الأحادي المشبك في المعالجة المركبة أو CNT المعاملة DIV 21 + ESNs. وجدنا أن التسمم من ESNs مع بونت / A- / G أو خيمة تسبب فقدان> 95٪ من النشاط متشابك في غضون 20 ساعة في جميع الحالات. بإجراء مزيد من توصيف 20 ساعة بعد التسمم مع بونت / A كشفت عن وجود تأثير تعتمد على الجرعة على النشاط متشابك، مع الحد من الكشف أدناه 0.005 PM وقيمة IC 50 من 0.013 PM. وتشير هذه النتائج إلى أن حساسية والإطار الزمني للكشف الكهربية من التسمم وتحسنت بشكل كبير خلال مقارنة القائم على طخة مناعية آناlyses من SNAP-25 الانقسام والحية المقايسات الماوس الفتك، مما يدل على أن القياسات الوظيفية للتسمم في الثقافات الخلايا العصبية نشطة synaptically قد تسهل طرق أكثر حساسية ومحددة وسريعة لتوصيف الاستجابة الخلوية لبونت.
المعيار الذهبي الحالي للكشف عن CNT، وتحديد النمط المصلي والكميات هو MLA. وMLA يستجوب مجموعة كاملة من المضيف: انشقاق تفاعلات السم اللازمة لالتسمم تحدث في الجسم الحي (على سبيل المثال، السم ملزمة لمستقبلات سطح الخلية، واستيعاب للمجمع السم مستقبلات، LC النبات إلى السيتوبلازم، LC بوساطة من الركيزة و تثبيط العصبي متشابك) 18. ومع ذلك، على الرغم من أن MLA تقدم نموذجا ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للتسمم، فمن موارد كثيفة، يمكن مرتبك من الملوثات وينطوي على أعداد كبيرة من الفئران مع الموت باعتباره نقطة النهاية. بدلا من ذلك، المقايسات خلية القاعدة للكشف بونت والكميات اقتصرت على الثقافات الخلايا العصبية الأولية، والتي تتطلب أيضا استخدام الحيواني، أو خطوط الخلايا العصبية، التي لا تشكل نقاط الاشتباك العصبي وتظهر عادة سيئة الحساسية للأعصاب 8. وحتى الآن، فإن معظم قياسات سكر في الوقد اعتمدت منصات خلية القاعدة جنوب شرقي على الكشف عن انشقاق بروتين من SNAP-25، VAMP1 / 2 أو syntaxin-1 11. وهذه مشكلة لأنه قد ثبت أن بروتين كمين الانقسام أن تكون مرتبطة غير خطي مع تثبيط متشابك في الجسم الحي، وبالتالي قد لا تمثل بدقة التسمم أو الشفاء من التسمم 19،20.
ومن شأن نظام النموذج القائم على خلية مثالية للكشف عن CNT (ط) أن يكون القائم على الخلايا العصبية. (ب) أن يقترن synaptically مع الاستجابات الكهربائية neurotypic. (ج) تكون حساسة للغاية لجميع الأنماط المصلية CNT أو فرعية. و (د) عرض التدرجية، والإنتاجية وفحص الأوقات التي تعادل أو المحسنة خلال MLA، بتكلفة أقل، ودون الحاجة إلى استخدام الحيوانات. لتلبية هذه الاحتياجات، قمنا بتطوير طريقة لإنتاج كميات كبيرة من التخصيب والثقافات شبكية لglutamatergic والخلايا العصبية GABAergic من المتاحة تجاريا خطوط الماوس ESC. نحن بعد ذلك وضعت الفحص ميست لتحديدتثبيط متشابك ردا على التسمم مع خيمة وبونت / A- / G. بينما يمكن إجراء الفحص ميست على أية مجموعة من السكان الخلايا العصبية نشطة synaptically (على سبيل المثال، الخلايا العصبية الأولية أو شرائح الدماغ)، حاليا ESNs هي فقط في المختبر المستمدة نموذج الخلايا العصبية التي تطور بتكاثر السلوكيات شبكة الناشئة وبالتالي فهو مناسب للمقايسة ميست.
تنتج كميات كافية من الخلايا العصبية من النسب المحددة للدراسات CNT المطلوبة العديد من الابتكارات في الثقافة ESC والتمايز. أولا، من خلال تحديد للزراعة والمجالس الاقتصادية والاجتماعية التي يمكن البقاء على قيد الحياة تعليق-التكيف، فإننا التخلص من احتمال تلوث بواسطة الخلايا المغذية، والحاجة إلى تنقية الخلايا المغذية من المجالس الاقتصادية والاجتماعية في بداية التمايز. على الرغم من أن الآليات الجزيئية الكامنة وراء تعليق-التكيف غير معروفة، لا تزال المجالس الاقتصادية والاجتماعية-تكييفها تعليق النشطة ميتوتيكلي والاحتفاظ بها Oct3 / 4 التعبير وستظل العصبية. باستخدام هذه الطريقة، ~ 1.5 × 10 7 Eوعادة ما يتم استردادها اللجان الدائمة كل ممر. ثانيا، تم زيادة إنتاج الشخصيات ~ 300٪ من خلال دمج الإثارة الميكانيكية لمنع التكتل خلال التمايز، وزيادة ظاهريا الوصول إلى المغذيات الداخلية للركام. وخلال هذه العملية، وجدنا أن المصل المستخدمة للثقافة ESC وتمايز الخلايا العصبية هو العنصر الأكثر أهمية في الحفاظ على المجالس الاقتصادية والاجتماعية العصبية. للحصول على أفضل نجاح، ونحن نوصي تعليق التكيف خلايا ES لبعضها الكثير من المصل وتخزين المصل عند -20 درجة مئوية إلى دعم الثقافة ESC وتمايز الخلايا العصبية من خلال تاريخ انتهاء الصلاحية.
كما هو الحال مع معظم الثقافات النشطة synaptically، DIV 14 + ESNs هي عرضة للتغيرات مفاجئة في درجة الحموضة، وحتى التعرض قصيرة إلى الغلاف الجوي CO 2 يمكن تركيزات يؤدي إلى العصبية خلال 24 ساعة. للتجارب التي تتطلب العلاج الثقافات تليها حضانات O / N أو أكثر، يجب أن تعامل الخلايا العصبية مباشرة دائم طن الحاضنة أو نقلها إلى ثابت CO 2 غرفة قبل التجريب.
مجموعة متنوعة من التقنيات وأكدت تكوين الخلايا العصبية والخلايا العصبية النضج، بما في ذلك المحكمة الجنائية الدولية، النسخي وخلية كاملة التصحيح، المشبك الكهربية. وكانت التغيرات الزمانية في التعبير الجيني والخلايا العصبية التشكل بما يتفق مع التقدم السريع من خلال مراحل تطور الخلايا العصبية، وDIV 16، عرضت ESNs مثير والمثبطة تيارات ما بعد متشابك مصغرة مع شبكة الناشئة السلوكيات 16. اقترح دليل على النشاط متشابك أن ESNs قد تكرار pathophysiologies المسؤولة عن المظاهر السريرية للالتسمم الغذائي والكزاز. وهذا ما أكده باستخدام ميست لإظهار أن التسمم مع بونت / A- / G أو خيمة ضعاف الترددات mEPSC التي كتبها> 95٪ مقارنة مع الخلايا العصبية المعالجة المركبة أو غير المعالجة.
وأشارت قياسات لحساسية ميست لبونت / أ أ المثبطة متوسطتركيز (IC 50) من 0.013 PM (ما يعادل 0.5 الماوس وحدة قاتلة / مل) وحد من الكشف أدناه 0.005 م، قياس في 20 ساعة بعد إضافة حمام. وبناء على هذه القيم، ميست هو تقريبا ضعف حساسة مثل و2-4 مرات أسرع من MLA و 30 أضعاف أكثر حساسية من الكشف القائم على طخة مناعية من المشقوق SNAP-25.
بشكل جماعي، وهذه البيانات تشير إلى أن السكان بالشبكة من الخلايا العصبية الجذعية المشتقة من خلية تقدم، نموذج قائم على خلية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للتسمم. جنبا إلى جنب مع أساليب محسنة لاستخلاص الثقافات ESN الشبكية من المجالس الاقتصادية والاجتماعية-تكييفها تعليق، يجب استخدام ميست تقلل من الحاجة إلى التجارب على الحيوانات والمساوئ المرتبطة بها والتكاليف والمخاوف الأخلاقية للMLA في الوقت الذي توفر مقياسا أكثر سرعة، حساس ونوعي ل التسمم. وعلى الرغم من خلية كاملة التصحيح، المشبك الكهربية هي طريقة منخفضة الإنتاجية لتحديد وجود أعصاب النشطة، وهو يقدم القرار، وجمعية مهندسي البترولإد الذي لا يمكن تحقيقه باستخدام الطرق الجزيئية. كما توفر هذه النتائج دليل على أن تطبيق الأساليب التي تعتمد على النشاط لتقييم النشاط متشابك وربما تمكن سلوك الشبكة الكشف السريع ومحددة من أعصاب. ان مثل هذه النهج إنتاجية أعلى جعل الدراسات الميكانيكية، وفحص العلاجي أو المقايسات التشخيصية الممكنة لمجموعة واسعة من وكلاء neuromodulatory، بما في ذلك الأنابيب النانوية الكربونية.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للمعهد الصحة الوطني للحساسية والأمراض المعدية (IAA عدد AOD12058-0001-0000) ووكالة الدفاع لتقليص التهديد – علوم المشتركة ومكتب التكنولوجيا، الطبية S & T قسم (أرقام المنح CBM.THRTOX.01.10 .RC.023 وCBM.THRTOX.01.RC.014). تم إجراء هذا البحث أثناء احتجازهم PB تهديد الدفاع للحد من جائزة الوكالة الوطنية للمجلس البحوث زمالة البحوث وعقد KH جائزة المجلس الوطني للبحوث زمالة أبحاث. نشكر أنجيلا آدكنز وKaylie Tuznik (USAMRICD) للحصول على المساعدة التقنية؛ وسيندي Kronman (USAMRICD) للحصول على المساعدة التحريرية. الآراء الواردة في هذا المقال هي آراء أصحابها ولا تعكس السياسة الرسمية لوزارة الجيش، وزارة الدفاع، أو الحكومة الأمريكية.
Table 1. ESC and ESN | ||||
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
|
100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
|
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL | |
ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL | |
55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL | |
107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
|
100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
|
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL | |
ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL | |
Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
|
0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
|
Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg | |
Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
|
Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
|
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 | |
DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
|
100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
|
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
|
50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
|
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL | |
100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL | |
5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
|
Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | ||
TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
|
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT | |
soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C | |
ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT | |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. | |
retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. | |
Table 2. MIST | ||||
NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
|
KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
|
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
|
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
|
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
|
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
|
K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
|
NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
|
Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
|
Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
|
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
|
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
|
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 380.35 MW: 1 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
|
bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
|
CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
|
Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
|
BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
|
Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
|
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
|
Table 3. Equipment and Software | ||||
MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software | |
Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings | |
Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software | |
Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | ||
micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | ||
patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | ||
micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | ||
borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 | |
18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | ||
plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | ||
cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | ||
Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | ||
low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 | |
bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |