Campione strategie di preparazione per la Spettrometria di Massa Imaging di 3D Models Cultura cellulare

Coltura cellulare 1. 3D e preparazione per Imaging

1. Cultura una linea cellulare adeguata, vale a dire, HCT116 colon carcinoma linea di cellule, in due dimensioni, cultura monostrato.
2. Grow HCT 116 cellule in un pallone T-25 con mezzi di McCoy 5A + 10% siero fetale bovino in un incubatore CO ₂ 5% fino al 50-70% di confluenza, che richiede generalmente un paio di giorni.
3. Celle di uscita con 0,25% soluzione di tripsina-EDTA e contano una parte delle cellule utilizzando un emocitometro e trypan blu colorazione per verificare la densità cellulare e la vitalità.
4. Dopo conteggio diluire le cellule con mezzo completo per ottenere un adeguato densità di semina di 6000 cellule / pozzetto, o 30.000 cellule / ml.

2. Preparare Agarose Micropiastre 96 pozzetti

1. Aggiungere 0,19 g di agarosio a 10 ml di media normale in una provetta da 50 ml (soluzione di agarosio 1,5% in media) ^10. Garantire incorporazione delicatamente miscelazione. Sterilizzare l'agarosio in un bagno d'acquaper 20 min.
2. Utilizzando una pipetta multicanale, aspirato 50 ml di miscela agarosio + supporti nei 60 pozzi centrali del fondo 96 e piastra di coltura piatto piano. Come i pozzetti a bordi periferici della piastra hanno tassi di evaporazione leggermente superiori, aggiungere 200 microlitri 1x fosfato salina tamponata (PBS) invece del agarosio a questi bordi.
3. Una volta che la miscela agarosio è stato aggiunto ai pozzetti interni, impostare la piastra lasciate raffreddare a ~ 37 ° C prima dell'aggiunta delle cellule.

3. Seed e tendono la cultura tridimensionale

NOTA: Più o meno cellule possono essere seminate in funzione delle esigenze della cultura coinvolte, ma è stato determinato che tali condizioni producono strutture 3D coltura cellulare di circa 1 mm di diametro dopo 10-14 giorni di coltura (dati non mostrati) .

1. Aggiungere 200 ml di soluzione di cella appropriata (diluito per contenere ~ 6.000 celle) al agarosio rivestito96 pozzetti. Coprire la piastra e impostare in incubatrice umidificata con 5% di CO ₂ a 37 ° C per la crescita cellulare.
2. Cambiare supporti cellulari almeno ogni 48 ore, o quando appare il supporto da cambiare colore.
   1. Cambiare mezzi aspirando accuratamente il vecchio media di tutto il piccolo coltura cellulare 3D (visibile ad occhio nudo per giorno 2) nella parte inferiore della agarosio. Aggiungere 200 ml di mezzi freschi delicatamente sopra la coltura cellulare 3D.
   2. (Passo opzionale) Durante questi cambiamenti dei media, aggiungere chemioterapici o altri farmaci per il test. Diluire il farmaco di scelta per la concentrazione finale con i media completo e aggiungere i necessari 200 ml di ogni bene.
   3. Monitor 3D crescita coltura cellulare al microscopio ottico, finché le colture cellulari 3D sono di circa 1 mm di diametro.

4. Harvest colture cellulari 3D

1. Utilizzare un 2 ml pipetta sierologica per rimuovere delicatamente la coltura cellulare 3D dal letto agarosio.
<li> Lavare le colture cellulari 3D con PBS da loro pipettando delicatamente circa 1 ml di PBS in un attesa di 24 pozzetti.
2. Trasferimento raccolto colture cellulari 3D via pipetta sierologica per provette per l'estrazione di proteine ​​o metaboliti, o incorporare in un mezzo taglio per aiutare nella affettare per applicazioni di imaging.

5. Inserire le colture cellulari 3D in gelatina

1. Preparare una soluzione di ~ 175 mg / ml di gelatina in acqua ad elevata purezza (18 MW preferito). ^22,23 Mescolare la gelatina vigorosamente. Osservare la soluzione diventa viscoso e difficile da manipolare. Posizionare il tubo conico-gelatina contenente in un bagno di acqua a 60 ° C e caldo fino a quando la soluzione diventa chiara e facile da aspirare.
   NOTA: La soluzione di gelatina calda indurisce rapidamente quando si raffredda, quindi effettuare tutte le seguenti fasi rapidamente prima del congelamento.
2. Dopo che è riscaldata, prendere immediatamente la gelatina alla cappa coltura cellulare. Mantenere il tubo con gelatina in beaker con acqua preriscaldata a circa 60 ° C per evitare l'indurimento della soluzione di gelatina.
3. Usando una pipetta 2 ml sierologica, depositare 0,6 ml della soluzione di gelatina calda nel pozzetto di una piastra a fondo piatto 24. Questo volume è sufficiente a coprire il fondo in un sottile strato. Depositare delicatamente le colture cellulari 3D immediatamente al di sopra dello strato di gelatina utilizzando un diverso pipetta 2 ml per evitare la rottura della struttura 3D.
   NOTA: Si deve prestare attenzione in questa fase non collocare PBS nella gelatina. In questo caso, però, rimuovere il PBS dalla parte superiore della gelatina con una pipetta 200 microlitri.
4. Dopo le colture cellulari 3D sono posti sulla superficie dello strato di gelatina, pipettatura un'altra 0,6 ml della miscela calda gelatina sopra le colture cellulari 3D, in modo da non disturbare la posizione delle culture. Dopo il secondo strato è posto, congelare le colture cellulari 3D gelatina incorporato a -80 ° C.

6. Slice e Thaw Monte the gelatina-integrato colture cellulari 3D per Mass spettrometrica Imaging

1. Rimuovere la piastra ben 24 contenente le colture cellulari in 3D dal congelatore. Scaldare il fondo del piatto con il calore dalla tua mano fino a quando una pinzetta o bisturi scivoleranno dolcemente verso il lato del bene.
2. Uniformemente scorrere la pinzetta o bisturi, liberando la gelatina, senza scongelare il centro. Prendere una goccia d'acqua al supporto criostato e utilizzare questa aderire il disco di gelatina al supporto.
   1. Colture cellulari 3D incorporati in gelatina sono più suscettibili di affettare a -30 ° C. Pulire la lama criostato e vetro con il 70% di etanolo prima dell'uso. Utilizzare una parte diversa della lama o una nuova lama per ogni cella disco 3D cultura gelatina per impedire opacizzare della lama.
3. Utilizzando il criostato, delicatamente affronteranno la gelatina in eccesso fino a quando le colture cellulari 3D diventano visibili.
4. A questo punto lentamente tagliare le colture cellulari 3D con un movimento regolare in 12-16 micron sezioni.
   NOTA: fattori critici di affettatura includono la distanza del vetro alla lama, l'angolo della lama, la temperatura del criostato, e l'angolo del disco sul supporto, quindi tutti questi devono essere controllati per garantire risultati coerenti.
5. Scongelare delicatamente le fette e li montano sul indio ossido di titanio (ITO) vetrini Rivestiti etichettati in modo appropriato e conservarlo in un essiccatore. Utilizzare le fette più rapidamente possibile per la massima qualità.

7. Matrix applicazione e preparazione del campione per MALDI Imaging

1. Prima di imaging MALDI, preparare fette con matrice appropriata.
   1. Per piccola analisi molecola, sono generalmente richieste fasi di lavaggio. Per il rilevamento di proteine ​​intatte, lavare le fette a freddo 100% di acetone, il fluido di Carnoy, o al 70% / 95% isopropanolo per rimuovere piccole molecole, come i lipidi che potrebbero mascherare il segnale ^{24 -. 26}
   2. Lavare delicatamente per non più di 30 secondi alla volta. Nondisturbare eventuali fette.
2. Preparare matrice in una soluzione di solvente organico e acqua, con 0,1% TFA. Per piccola molecola come α-ciano-4-idrossicinnamico acido (CHCA), utilizzare 60% ​​ACN: 40% H ₂ O: 0,1% TFA (10 mg / ml). Per il rilevamento di proteine ​​come l'acido sinapico (30 mg / ml), la stessa soluzione solvente. Per solubilità ottimale dell'acido sinapico, dissolvere in acetonitrile prima dell'aggiunta del TFA: H ₂ O soluzione. Altre matrici possono essere utilizzati come appropriato.
   NOTA: Matrix può essere applicato con metodi diversi, ma va notato alcune matrici sono stati trovati per co-cristallizzare con la gelatina, come l'acido ferulico, rendendo inutilizzabile il campione. Cristalli più piccoli producono spettri di massa più consistente, consentendo specie più molecolari per individuare e attribuire alle differenze biologiche, piuttosto che gli effetti matrice.
3. Applicare matrice metodo handspotting.
   1. Utilizzare una siringa a punta fine di applicare 0,5 microlitri della matrsoluzione ix sulla fetta coltura cellulare 3D e consentire la matrice di cristallizzare.
4. In alternativa, utilizzare il metodo aerografo. Riempire un aerografo grado commerciale con la soluzione di matrice.
   1. Tenere lo spruzzatore 8-12 centimetri di distanza dalla diapositiva, puntare un vapore in slice. Tra passaggi, permettono la matrice asciugare per 1 min per consentire la migliore formazione di cristalli. Fino a 10-20 passi del airbrush è necessario per produrre un livello ottimale di matrice ^22.
5. In alternativa, utilizzare il metodo di sublimazione dettagliato altrove. ^25,27
6. Diapositive secchi in un essiccatore per almeno 30 minuti prima MALDI-MSI, indipendentemente dal metodo di applicazione della matrice. ²⁵

8. MALDI-MSI analisi utilizzando un sistema MALDI-TOF (ie, Autoflex III)

NOTA: Questa sezione contiene le istruzioni e consigli per l'impostazione dei parametri per un esperimento di imaging MALDI-TOF. A seconda delle insproduttore trument e software utilizzato, il processo può variare.

1. Inserire le diapositive in un adattatore fatto per tenere saldamente 75 millimetri x 25 millimetri diapositive immagine le fette di coltura cellulare 3D collegati a diapositive ITO rivestiti. Caricare l'adattatore slitta nello strumento.
2. Preparare lo strumento per MALDI-MSI selezionando uno standard di calibrazione appropriato per la gamma messa in questione. Per interrogatori di piccole molecole, i segnali rilevati corrispondenti alla matrice utilizzata, α-CHCA, sono un gruppo comune dei calibranti. Per l'analisi delle proteine, standard proteina nota (ad esempio, l'ubiquitina, tripsinogeno) nel range di massa di interesse vengono selezionati e individuati adiacente alle colture cellulari 3D come calibratori. Calibrare lo strumento prima di procedere con lo sviluppo del metodo.
3. Prima di imaging, sviluppare metodi di acquisizione dati per l'intervallo di massa di scelta utilizzando il software fornito dal produttore dello strumento. Vedi figure 1 e 2 perpiccola molecola proteica e di imaging. Per le piccole immagini molecola, utilizzare reflectron modalità per la più alta risoluzione di massa.
   1. Regolare l'intervallo di massa per l'acquisizione dati piccola molecola tra 100-1.000 m / z e per le proteine ​​tra 8.000 25.000 m / z. Regolare il range di massa per comprendere la regione scelta fornendo la massima risoluzione di massa possibile con lo strumento.
   2. Regolare potenza del laser, la frequenza, il numero di scatti laser e dimensione dello spot utilizzando la soluzione di calibrazione e una vicina fetta 'sacrificale' coltura cellulare 3D. Rispettare queste impostazioni nel software principale di controllo dello strumento. Utilizzare le seguenti impostazioni come punto di partenza consigliato: potenza del 60%, 400 colpi laser, ultra piccola dimensione del punto. Queste impostazioni varieranno tra strumenti e metodi, così ottimizzare i parametri dello strumento per dare gli spettri più di alta qualità per ogni strumento specifico. Altri parametri che possono essere regolati includono il guadagno del rivelatore, frequenza di campionamento, e il guadagno elettronico. Save questo metodo per l'utilizzo del software di imaging (es., Metodo Esecuzione automatica che FlexImaging si avvarrà).
      NOTA: ioni Soppressione di sotto del range di massa di interesse (nuovo trovato nel controllo dello strumento) in modo da non interferire con il riconoscimento.
   3. Sviluppare proteine ​​metodi di acquisizione dati per l'intervallo di massa di scelta. Seguite la stessa procedura di cui sopra, ma per le gamme di massa medio-alto, sopra di circa 3 kDa, utilizzare la modalità lineare.
      NOTA: Le impostazioni saranno diversi da quelli utilizzati per i piccoli metodi di molecola.
4. Setup specifici parametri dello strumento MS utilizzando il software di imaging fornito dal costruttore dello strumento, come ad esempio per i sistemi FlexImaging Bruker MALDI-TOF.
   1. Creare un nuovo file di immagini e cartelle, utilizzando i metodi sviluppati prima e salvati. Selezionare i parametri dello strumento come il formato di punto raster (cambiamento dal difetto circa 200 micron a 50 micron), impostare il metodo di controllo strumento (impostazione al punto 8.3.2 o 8.3.3), e posizione dove eseguire la scansione in coltura cellulare 3D.
   2. Selezionare tre punti teach appropriate sul campione, spostando il laser a turno. Ottenere la fotografia ottica dal software di controllo laser MALDI-TOF utilizzando 'schermata di stampa'.
      NOTA: Molti programmi software di imaging richiedono una fotografia ottica del campione 'insegnare' il software in cui si trova il laser, che può essere ottenuto con uno scanner o spesso fotocamera strumento.
5. Quindi avviare il processo di imaging dal software di imaging (non il controllo dello strumento) e di acquisire spettri di massa da ogni fetta. Osservare la maggior parte delle masse attraverso la coltura cellulare 3D e altre localizzate in aree particolari.

9. opzionali Dati metodi di analisi

1. Per l'analisi mirata, effettuare analisi manuale degli spettri facendo clic su una massa nello spettro media, o consentire il software di imaging per raccogliere automaticamente le masse di sopra di una determinata soglia (ad es., Picchi abil sobrio all'inizio soglia del 20%). Per il controllo di qualità, esaminare la distribuzione dei picchi di matrice o spettro media.
2. Effettuare analisi statistiche con set di dati estratti nel software matematico, come R o Matlab.
   1. Export singolo spettri in formato ASCII, un file di testo leggibile, per il caricamento nel software di scelta.
   2. Convertire gli spettri individuo a ASCII, mzXML, formato mzML per la lettura da diversi programmi software diversi, ^{28 -. 31} o esportare i dati come Analyze (.img) file di formato, un formato comune utilizzato per altre applicazioni di imaging come la risonanza magnetica ³² Due opzioni open source per l'analisi sono MSiReader e BioMap ^32,33.
   3. Una volta che i file vengono esportati in un formato leggibile dal software, caricare il set di dati tramite le istruzioni del relativo software. Dopo il caricamento, eseguire l'elaborazione post-acquisizione, come la rimozione di base e la normalizzazione.
   4. Con questo insieme di dati, eseguire ferrtrattamenti stical quali analisi delle componenti principali di clustering gerarchico utilizzando sia script personalizzati o incorporati in algoritmi in software come Matlab ^18.

Immagini MSI ha il potenziale per rivelare molte distribuzioni molecolari diversi in colture cellulari 3D. Utilizzando il metodo descritto sopra, specie da piccole molecole (Figura 1) per grandi proteine ​​(Figura 2) possono essere monitorati attraverso la cultura. Questi risultati mostrano la visualizzazione di un singolo ione con lo strumento gratuito MSiReader. ³² I risultati possono essere analizzati per singoli ioni di interesse attraverso la coltura cellulare 3D con software di visualizzazione in una regione di interesse o l'intera regione scansionata. Inoltre la maggior parte del software visualizzerà automaticamente ioni di sopra di una certa soglia impostata dall'utente, che può aiutare gli sforzi di scoperta. Una volta che si ottengono mappe singolo ione, più software include la capacità di sovrapporre le immagini per vedere la colocalizzazione di ioni. Sia in approcci discovery-based o in modo mirato, l'imaging spettrometria di massa è un potente strumento per analizzare colture cellulari 3D.

Figura 1. Risultati rappresentativi del 3D crescita coltura cellulare e sezionamento. Sinistra) ottico di immagine di una struttura di coltura cellulare colorettale HCT-116 3D intatta come visto il giorno 14 prima della raccolta. Destra) ottico di immagine di una fetta di circa equatoriale un colorettale 3D coltura cellulare disgelo montato su uno scivolo di ITO rivestito per l'imaging. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Risultati rappresentativi di piccola molecola MALDI-MSI di una sezione equatoriale di una coltura cellulare 3D. Top) spettri di massa medio ottenuto con α-CHCA in gamma bassa massa (piccola molecola). Basso) Immagini rappresentative dellauna massa unica: 327,8 m / z localizzata principalmente all'interno della coltura cellulare 3D e 429,7 m / z localizzata principalmente al bordo della coltura cellulare 3D. La linea tratteggiata indica il margine approssimativo della sferoide. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Risultati rappresentativi dell'imaging proteine ​​di MALDI-MSI di una sezione equatoriale di una coltura cellulare 3D. Top) spettri di massa medio ottenuto con l'acido sinapico in alto (intervallo di proteine) di massa. Inferiore) Immagini rappresentative di una massa unica: 10.871 m / z localizzata principalmente al bordo dello sferoide, e 12.184 m / z localizzato più verso l'interno dello sferoide. La linea tratteggiata indica il bordo approssimativa dello sferoide. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Utilizzando i metodi di cui sopra, colture cellulari 3D possono essere coltivate e analizzati con MALDI-MSI. Molte linee cellulari immortali formeranno strutture 3D quando coltivate in modo appropriato. ^9,10 deve prestare attenzione a coltivare le cellule che non sono stati superati troppe volte, cioè, hanno numeri di passaggio basso. In generale, le cellule con numeri passaggio di dieci e inferiore sono ottimali per la coltivazione di colture cellulari 3D. Crescere le colture cellulari in 3D in un supporto tradizionale agarosio fornisce un modo conveniente per gruppi di ricerca interessati alla coltura cellulare 3D per provare questo sistema. Questo metodo utilizza pochi componenti non già nella maggior parte dei laboratori di coltura cellulare di mammifero. Particolare attenzione deve essere rivolta alla preparazione dei piatti agarosio per la crescita in modo che le colture cellulari 3D sono coerenti per forma e dimensioni; alcuni aspetti che richiedono attenzione includono controllando che bolle d'aria sono intrappolate alla miscela e che un adeguato menisco viene formato nella parte inferiore di ciascun well. Se il menisco non forma correttamente, le cellule possono crescere in forme non sferoidali o in piccoli grumi. Inoltre, bisogna fare attenzione a non mettere PBS in gelatina con sferoidi. Se questo accade, rimuovere il PBS dalla parte superiore della gelatina con una pipetta 200 microlitri. Se il costo non è un fattore, piastre inferiori rotonde vincolanti ultra-basse sono commercialmente disponibili e offrono la semplificazione di questi passi. Mentre altri metodi all'incorporamento tessuti possono anche essere compatibile spettrometria costosa e non di massa, gelatina-embedding ha dimostrato di essere sia poco costoso e versatile. Strategie di preparazione di cui sopra sono state ottimizzate per colture cellulari in 3D per ottenere i dati di altissima qualità. Mentre gelatina-embedding ha dimostrato di essere compatibile con l'analisi di spettrometria di massa, questo processo non restringere le matrici disponibili a causa di co-cristallizzazione. Una volta congelato, le colture cellulari in 3D sono stabili per mesi fino a quando non sono congelamento-scongelamento. La gelatina diventa opaco quando congelato, e la cellula 3Dculture sono di un colore simile, quindi è consigliabile prima del congelamento per documentare il posizionamento coltura cellulare 3D per aiutare a taglio.

Nel preparare diapositive, matrice può essere applicato con metodi diversi, ma va notato che alcune matrici sono stati trovati per co-cristallizzare con la gelatina, come l'acido ferulico, rendendo inutilizzabile il campione. Cristalli di matrice più piccoli producono spettri di massa più consistente. Mentre handspotting è il metodo più semplice di applicazione della matrice, il volume di solvente più grande può comportare misure di cristallo più grandi e significative migrazioni analiti.

Al spettrometro di massa, i progressi nelle tecnologie MALDI-MSI hanno ridotto le competenze necessarie per le analisi inizio. L'acquisizione dei dati e l'analisi è semplice sulla maggior parte dei sistemi, permettendo anche un principiante di ottenere informazioni di alta qualità da diapositive ITO-rivestiti. Un'attenta selezione dei parametri dello strumento, ottimizzato sulla vicina non un'immagine degna 3D cultur cellularees, è fondamentale per ottenere dati di alta qualità. Ad esempio, aumentando la potenza del laser può aumentare l'intensità di picco ma diminuire la potenza del laser può migliorare la risoluzione e dare forma dei picchi più simmetrici. Colture cellulari 3D devono essere utilizzati rapidamente dopo il taglio al fine di garantire una qualità ottimale del campione. Degradazione del segnale di proteina può essere visto in meno di una settimana senza corretta conservazione (essiccatore / -80 ° C freezer), in particolare nella regione ad alta massa (circa 20 kDa). A causa della crescente domanda, sono stati sviluppati molti programmi software di visualizzazione differenti e sono liberi al pubblico di ricerca. La maggior parte degli spettrometri di massa di imaging hanno installato il software necessario per visualizzare i singoli masse con i formati proprietari utilizzati su ogni strumento. Questi programmi software possono essere utilizzati per ottenere immagini single-massa ed esportare i dati. La maggior parte del software permetterà anche la sovrapposizione di due o più masse di interesse. Inoltre, molti spettatori diversi per i dati MSI sono da scaricare gratuitamente, come ad esempio un MSiReaderd BioMap. ^32,33 I dati di spettrometria di massa ottenuti possono anche essere trattati post-acquisizione con facilità, portando informazioni più utili alla ribalta.

Da farmaceutici a lipidi alle proteine, il sistema sopra descritto permette una rapida acquisizione di dati per valutare la distribuzione delle molecole di interesse in una struttura di coltura cellulare 3D. Sezioni seriali possono essere adottate per immagine dell'intera struttura 3D costruendo da ogni immagine 2D di una fetta di coltura cellulare 3D. Le tecniche e le note del protocollo saranno di utilità per i ricercatori che desiderano iniziare a coltura cellulare tridimensionale come un ponte tra la cultura monostrato e modelli animali. Una volta masterizzato, queste tecniche possono essere applicate a diversi tipi di colture cellulari 3D, tessuti e colture cellulari, consentendo ai ricercatori di immagine a seconda di quale dei campioni che scelgono.