Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

عينة استراتيجيات التحضير للتصوير الطيف الكتلي لل3D الثقافة خلية نماذج

Published: December 5, 2014 doi: 10.3791/52313
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Notre Dame, 2Harper Cancer Research Institute, University of Notre Dame

Summary

خطوط الخلايا السرطانية خلد يمكن زراعتها، لأن الحضارات خلية 3D، نموذجا قيما لالأبحاث البيولوجية. يصف هذا البروتوكول التصوير قياس الطيف الكتلي من مزارع الخلايا 3D، بما في ذلك تحسينات في منصة إعداد العينات. والهدف من هذا البروتوكول هو لإرشاد المستخدمين لإعداد مزارع الخلايا 3D لتحليل التصوير قياس الطيف الكتلي.

Protocol

1. 3D خلية ثقافة والتحضير للتصوير

  1. ثقافة خط الخلية المناسب، أي HCT116 خط خلية سرطان القولون، في الأبعاد والثقافة أحادي الطبقة اثنين.
  2. تنمو HCT 116 الخلايا في قارورة T-25 مع وسائل الإعلام 5A مكوي و+ 10٪ مصل بقري جنيني في 5٪ CO 2 الحاضنة حتى 50-70٪ confluency، والتي تأخذ عادة بضعة أيام.
  3. خلايا الإفراج مع 0.25٪ محلول التربسين-EDTA وتحسب جزء من الخلايا باستخدام عدادة الكريات والتريبان تلطيخ الأزرق للتحقق من كثافة الخلايا وقدرتها على البقاء.
  4. بعد الفرز، وتمييع الخلايا مع المتوسط ​​كاملة لتحقيق كثافة البذر المناسبة 6،000 خلية / جيدا، أو 30،000 خلية / مل.

2. إعداد المغلفة الاغاروز 96 لوحات جيدة

  1. إضافة 0.19 غرام من الاغاروز إلى 10 مل من وسائل الاعلام القياسية في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل (1.5٪ محلول الاغاروز في وسائل الإعلام) 10. ضمان التأسيس عن طريق خلط لطيف. الأوتوكلاف الاغاروز في حمام مائيلمدة 20 دقيقة.
  2. باستخدام ماصة الأقنية، نضح 50 ميكرولتر من الاغاروز + وسائل الإعلام الخليط في الآبار المركزية 60 من مسطحة القاع جيدا 96 لوحة لوحة الثقافة. كما الآبار في الحواف المحيطية من لوحة لها أعلى قليلا معدلات التبخر، وإضافة 200 ميكرولتر 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بدلا من الاغاروز لهذه الحواف.
  3. مرة واحدة تمت إضافة خليط الاغاروز إلى الآبار الداخلية، وتعيين لوحة جانبا لتبرد إلى ~ 37 ° C قبل إضافة الخلايا.

3. البذور وتميل ثقافة ثلاثي الأبعاد

ملاحظة: قد يتم المصنف عن خلايا أو أقل اعتمادا على متطلبات الثقافة المعنية، ولكن تم تحديد أن هذه الظروف تؤدي إلى 3D هياكل الثقافة خلية من حوالي 1 ملم في القطر بعد 10-14 يوما من ثقافة (لا تظهر البيانات) .

  1. إضافة 200 ميكرولتر من الحل خلية المناسب (المخفف لاحتواء ~ 6،000 خلايا) إلى الاغاروز المغلفة96 لوحة جيدا. تغطية لوحة وتدور أحداثه في حاضنة مرطب مع CO 2 5٪ عند 37 درجة مئوية لنمو الخلايا.
  2. تغيير وسائل الإعلام خلية كحد أدنى من كل 48 ساعة، أو عند ظهور وسائل الإعلام إلى أن تغيير اللون.
    1. تغيير وسائل الإعلام بواسطة الشفط بعناية وسائل الإعلام القديمة من حول زراعة الخلايا 3D صغيرة (مرئية للعين المجردة يوم 2) في الجزء السفلي من الاغاروز. إضافة 200 ميكرولتر من وسائل الاعلام الطازج بلطف على زراعة الخلايا 3D.
    2. (خطوة اختيارية) وخلال هذه التغييرات وسائل الإعلام، إضافة مبحث المعالجة الكيميائية أو غيرها من المخدرات للاختبار. تمييع الدواء المفضل لتركيز النهائي مع وسائل الإعلام كاملة وإضافة 200 ميكرولتر المطلوبة إلى كل بئر.
    3. مراقبة 3D نمو ثقافة الخلية بواسطة المجهر الضوئي، وحتى مزارع الخلايا 3D ما يقرب من 1 ملم في القطر.

4. حصاد الثقافات خلية 3D

  1. استخدام 2 مل ماصة المصلية لإزالة بلطف ثقافة الخلية 3D من السرير الاغاروز.
    2. <لى> غسل مزارع الخلايا 3D مع برنامج تلفزيوني قبل pipetting بلطف لهم في ما يقرب من 1 مل PBS في انتظار 24 لوحة جيدا.
  2. نقل حصاد مزارع الخلايا 3D عبر الماصة المصلية لأنابيب الطرد المركزي للبروتين أو الأيض الاستخراج، أو تضمينها في وسط قطع للمساعدة تشريح لتطبيقات التصوير في.

5. تضمين الثقافات خلية 3D في الجيلاتين

  1. يعد حل من ~ 175 ملغ / مل الجيلاتين في الماء عالية النقاء (18 MΩ المفضل). 22،23 مزيج الجيلاتين بقوة. مراقبة الحل يصبح لزج ويصعب التلاعب. وضع أنبوب المخروطية التي تحتوي على الجيلاتين في حمام مائي في ~ 60 درجة مئوية ودافئة حتى يصبح حل واضح وسهل نضح.
    ملاحظة: الحل الجيلاتين الدافئ يصلب بسرعة لأنه يبرد، حتى تنفيذ كافة الخطوات التالية بسرعة قبل التجميد.
  2. بعد تسخينها، واتخاذ الجيلاتين فورا إلى غطاء محرك السيارة زراعة الخلايا. الحفاظ على أنبوب مع الجيلاتين في مكتب التحقيقات الفرنسىكير بالماء محمى على حرارة حوالي 60 ° C لتجنب تصلب حل الجيلاتين.
  3. باستخدام 2 مل ماصة المصلية، إيداع 0.6 مل من محلول الجيلاتين الدافئ في البئر من 24 لوحة مسطحة القاع. هذا الحجم يكفي لتغطية الجزء السفلي في طبقة رقيقة. إيداع بلطف الثقافات خلية 3D على الفور على رأس طبقة الجيلاتين باستخدام مختلف ماصة 2 مل لتجنب تمزق بنية 3D.
    يجب توخي الحذر في هذه المرحلة عدم وضع PBS في الجيلاتين: ملاحظة. إذا حدث هذا، ومع ذلك، إزالة PBS من الجزء العلوي من الجيلاتين باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
  4. بعد يتم وضع مزارع الخلايا 3D على سطح طبقة الجيلاتين، وماصة بعناية 0.6 مل أخرى من خليط الجيلاتين الدافئ على مزارع الخلايا 3D، وذلك لعدم إزعاج الموقف من الثقافات. بعد وضع الطبقة الثانية، وتجميد الثقافات خلية 3D جزءا لا يتجزأ من الجيلاتين في -80 ° C.

6. شريحة وذوبان جبل عشرالبريد الجيلاتين جزءا لا يتجزأ من 3D الثقافات خلية للتصوير قداس الطيفية

  1. إزالة لوحة 24 جيدا تحتوي على مزارع الخلايا 3D من الفريزر. الحارة الجزء السفلي من لوحة مع الحرارة من يدك حتى منتاش أو مشرط سوف تنزلق برفق أسفل الجانب من البئر.
  2. تنزلق بسلاسة منتاش أو مشرط، وتحرير الجيلاتين دون ذوبان المركز. خذ قطرة ماء إلى الدعم ناظم البرد واستخدام هذا التمسك القرص الجيلاتين إلى الدعم.
    1. مزارع الخلايا 3D جزءا لا يتجزأ من الجيلاتين هي الأكثر قابلة تشريح في -30 ° C إلى. تنظيف شفرة ناظم البرد والزجاج مع الايثانول 70٪ قبل الاستخدام. استخدام جزء مختلف من شفرة أو شفرة جديدة لكل خلية 3D القرص ثقافة الجيلاتين لمنع بله من النصل.
  3. باستخدام ناظم البرد، تواجه بلطف من الجيلاتين الزائدة حتى مزارع الخلايا 3D تصبح مرئية.
  4. عند هذه النقطة شريحة ببطء مزارع الخلايا 3D مع الحركة السلسة في 12-16 ميكرومتر أقسام.
    ملاحظة: العوامل الحاسمة لتشريح تشمل المسافة من الزجاج لشفرة، زاوية النصل، ودرجة حرارة ناظم البرد، وزاوية القرص على دعم، لذلك كل هذه يجب أن يتم التحقق لضمان تحقيق نتائج متسقة.
  5. ذوبان الجليد بعناية شرائح وجبل لهم على الإنديوم أكسيد التيتانيوم (ITO) الشرائح الزجاجية -coated وصفت بشكل مناسب وتخزينها في مجفف. استخدام شرائح في أسرع وقت ممكن لأقصى قدر من الجودة.

7. تطبيق مصفوفة وإعداد نموذج لMALDI التصوير

  1. قبل التصوير MALDI، وإعداد شرائح مع مصفوفة المناسبة.
    1. لتحليل جزيء صغير، يطلب من أي خطوات غسل عموما. للكشف عن البروتين سليمة، وغسل الشرائح في البارد 100٪ الأسيتون، والسوائل Carnoy، وأو 70٪ / 95٪ الأيزوبروبانول لإزالة جزيئات صغيرة مثل الدهون التي يمكن أن تحجب إشارة 24 - 26
    2. يغسل برفق لمدة لا تزيد عن 30 ثانية في كل مرة. لالزعزعة أي شرائح.
  2. إعداد مصفوفة في حل من المذيبات العضوية والماء، مع 0.1٪ TFA. لجزيء صغير مثل α-Cyano-4-hydroxycinnamic حمض (CHCA)، استخدم 60٪ ACN: H 2 O 40٪: 0.1٪ TFA (10 ملغ / مل). للكشف عن البروتين مثل حمض sinapic (30 ملغ / مل)، استخدام نفس محلول مذيب. لالذوبان الأمثل للحمض sinapic، ويحل لأول مرة في الأسيتونتريل قبل إضافة TFA: H 2 O الحل. ويمكن استخدام المصفوفات الأخرى حسب الاقتضاء.
    ملاحظة: مصفوفة يمكن تطبيقها مع عدة طرق مختلفة، ولكن تجدر الإشارة إلى فقد وجد أن بعض مصفوفات للمشاركة في crystalize مع الجيلاتين، مثل حمض الفيرليك، مما يجعل عينة غير صالحة للاستعمال. بلورات صغيرة تنتج أطياف الشامل أكثر اتساقا، مما يسمح للمزيد من الأنواع الجزيئية ليتم الكشف عن وينسب إلى الاختلافات البيولوجية بدلا من التأثيرات المصفوفة.
  3. تطبيق المصفوفة التي handspotting الأسلوب.
    1. استخدام حقنة ذات الرؤوس غرامة لتطبيق 0.5 ميكرولتر من MATRحل تاسعا على شريحة خلية ثقافة 3D والسماح للمصفوفة المتاحة لبلورة.
  4. بدلا من ذلك، استخدام الأسلوب البخاخة. ملء البخاخة الصف التجارية مع الحل المصفوفة.
    1. عقد بخاخ 8-12 بوصة بعيدا عن الشريحة، وتهدف إلى رذاذ دقيق في شريحة. في بين التمريرات، والسماح للمصفوفة لتجف لمدة 1 دقيقة للسماح لأفضل تشكيل وضوح الشمس. ما يصل الى 10-20 يمر من البخاخة مطلوب لإنتاج طبقة المثلى للمصفوفة 22.
  5. بدلا من ذلك، استخدام الأسلوب التسامي بالتفصيل في مكان آخر. 25،27
  6. الشرائح الجافة في مجفف لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل MALDI-MSI، بغض النظر عن طريقة تطبيق المصفوفة. 25

8. MALDI-MSI تحليل باستخدام نظام MALDI-TOF (أي AutoFlex III)

ملاحظة: يحتوي هذا القسم تعليمات والمشورة لوضع معايير لتجربة التصوير MALDI-TOF. اعتمادا على خصوصياتالشركة المصنعة trument والبرمجيات المستخدمة، قد تختلف هذه العملية.

  1. تناسب الشرائح في محول المبذولة لعقد آمن 75 مم × 25 مم الشرائح لصورة 3D شرائح زراعة الخلايا تعلق على الشرائح ITO المغلفة. تحميل محول الانزلاق الى الصك.
  2. إعداد أداة لMALDI-MSI عن طريق تحديد معيار المعايرة المناسب لمجموعة الشامل في السؤال. للاستجواب من الجزيئات الصغيرة، وإشارات الكشف التي تتوافق مع مصفوفة المستخدمة، α-CHCA، هي مجموعة واحدة مشتركة من calibrants. لتحليل البروتينات، ويتم اختيار معايير بروتين يعرف (أي اليوبيكويتين، مولد التريبسين) في نطاق شامل من الاهتمام ورصدت المتاخمة للمزارع الخلايا 3D كما calibrants. معايرة أداة قبل الشروع في تطوير الأسلوب.
  3. قبل التصوير، وتطوير أساليب الحصول على البيانات لمجموعة كتلة اختيار باستخدام البرامج المقدمة من قبل الشركة المصنعة الصك. انظر الشكلين 1 و 2 للجزيء صغير والتصوير البروتين. للتصوير جزيء صغير، استخدم reflectron وضع لأعلى دقة الشامل.
    1. ضبط نطاق الكتلة للحصول على البيانات جزيء صغير بين 100-1،000 م / ض وللبروتينات بين 8،000- 25،000 م / ض. ضبط نطاق الكتلة لتشمل المنطقة من خيار في الوقت الذي توفر أعلى دقة الشامل ممكن مع الصك.
    2. ضبط قوة الليزر، والتردد، وعدد من الطلقات الليزر وحجم البقعة باستخدام محلول المعايرة و"الأضاحي" شريحة ثقافة الخلية 3D القريبة. مراقبة هذه الإعدادات في البرنامج الرئيسي السيطرة الصك. استخدام الإعدادات التالية كنقطة انطلاق الموصى بها: السلطة 60٪، و 400 طلقات الليزر، فائقة حجم البقعة الصغيرة. وتختلف هذه الإعدادات عبر أدوات وطرق، لذلك تحسين المعلمات أداة لتقديم أعلى جودة الأطياف لكل صك معين. وتشمل العوامل الأخرى التي يمكن تعديلها المكسب كاشف، معدل العينة، وزيادة الإلكترونية. Sافي هذه الطريقة للاستخدام في برامج التصوير (أي.، AutoExecute الطريقة التي FlexImaging سوف تستفيد).
      ملاحظة: أيونات قمع تحت نطاق شامل من الفائدة (وجدت مرة أخرى في السيطرة الصك) حتى لا تتداخل مع الكشف.
    3. تطوير بروتين طرق الحصول على البيانات لمجموعة كتلة في الاختيار. اتبع نفس الخطوات المذكورة أعلاه، ولكن بالنسبة للنطاقات كتلة منتصف إلى أعلى مستوى، وقبل حوالي 3 كيلو دالتون، استخدام وضع خطي.
      ملاحظة: إعدادات تختلف عن تلك المستخدمة في أساليب جزيء صغير.
  4. محددة المعلمات أداة MS الإعداد باستخدام برامج التصوير المقدمة من قبل الشركة المصنعة الصك، مثل FlexImaging لأنظمة بروكر MALDI-TOF.
    1. إنشاء ملف جديد والتصوير مجلد، وذلك باستخدام الأساليب المتقدمة قبل وحفظها. حدد المعلمات أداة مثل حجم البقعة النقطية (تغيير من الافتراضي حوالي 200 ميكرون إلى 50 ميكرون)، وإعداد أسلوب التحكم أداة (الإعداد في الخطوة 8.3.2 أو 8.3.3)، وPOSIنشوئها حيث لمسح خلال زراعة الخلايا 3D.
    2. حدد ثلاث نقاط تعليم المناسبة على العينة، تحريك الليزر لكل بدوره. الحصول على صورة ضوئية من برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر MALDI-TOF باستخدام "طباعة الشاشة".
      ملاحظة: تتطلب العديد من برامج التصوير على صورة ضوئية من العينة إلى 'تعليم' البرنامج حيث يقع الليزر، والتي يمكن الحصول عليها مع الماسح الضوئي أو الكاميرا في كثير من الأحيان الصك.
  5. ثم تبدأ عملية التصوير من برامج التصوير (وليس السيطرة الصك) والحصول على أطياف الشامل من كل شريحة. مراقبة معظم الجماهير عبر زراعة الخلايا 3D وغيرها المترجمة إلى مناطق معينة.

9. اختياري طرق تحليل البيانات

  1. لتحليل المستهدفة، لتحليل اليدوي للأطياف بالضغط كتلة في الطيف متوسط، أو السماح للبرامج التصوير لالتقاط الجماهير تلقائيا فوق عتبة معينة (على سبيل المثال، قمم من أساسهااوفه أعلى عتبة 20٪). لمراقبة الجودة، ودراسة توزيع قمم مصفوفة أو الطيف المتوسط.
  2. أداء التحليلات الإحصائية مع مجموعات البيانات المستخرجة في البرامج الرياضية مثل R أو مطلب.
    1. تصدير الأطياف واحد في شكل ASCII، ملف نص مقروء، لتحميل في البرنامج في الاختيار.
    2. تحويل الأطياف الفردية لASCII، mzXML، من شكل mzML لقراءة عدة برامج مختلفة، 28 - 31 أو تصدير البيانات كملف شكل تحليل (.img)، صيغة مشتركة تستخدم في تطبيقات التصوير الأخرى مثل التصوير بالرنين المغناطيسي 32 خياران المصدر المفتوح للتحليل هي MSiReader وBioMap 32،33.
    3. مرة واحدة ويتم تصدير الملفات إلى تنسيق قابل للقراءة من قبل البرنامج، تحميل مجموعة البيانات عبر الإرشادات في البرنامج منها. بعد التحميل، تنفيذ معالجة ما بعد الشراء، مثل إزالة خط الأساس والتطبيع.
    4. مع هذه البينات، نفذ الستاتيالعلاجات stical مثل تحليل المكون الرئيسي من المجموعات الهرمية باستخدام البرامج النصية المخصصة أو التي بنيت في خوارزميات في مجال البرمجيات مثل ماتلاب 18.

Representative Results

MSI التصوير لديه القدرة على كشف الكثير من التوزيع الجزيئي مختلفة في مزارع الخلايا 3D. باستخدام طريقة المبينة أعلاه، يمكن تتبع الأنواع من الجزيئات الصغيرة (الشكل 1) للبروتينات كبيرة (الشكل 2) عبر الثقافة. وتشير هذه النتائج التصور من أيون واحد مع أداة مجانية يجوز تحليل MSiReader 32 نتائج للأيونات واحدة من الفائدة عبر زراعة الخلايا 3D مع برنامج التصور سواء في المنطقة ذات الاهتمام أو المنطقة الممسوحة ضوئيا بأكملها. بالإضافة إلى ذلك فإن معظم البرامج تصور تلقائيا أيونات فوق عتبة معينة تحدد من قبل المستخدم، والتي قد تساعد جهود الاكتشاف. مرة واحدة ويتم الحصول على خرائط ايون واحدة، ويشمل معظم برامج القدرة على تراكب الصور لعرض colocalization من الأيونات. إما في النهج المستندة إلى اكتشاف أو بطريقة المستهدفة، والتصوير قياس الطيف الكتلي هو أداة قوية لتحليل الثقافات خلية 3D.

في صفحة = "دائما"> الشكل (1)
الشكل 1. ممثل النتائج من 3D نمو ثقافة الخلية وباجتزاء. اليسار) صورة ضوئية من القولون والمستقيم HCT-116 3D بنية الثقافة خلية سليمة كما تراه في يوم 14 قبل الحصاد. اليمين) صورة ضوئية من شريحة الاستوائية تقريبا من القولون والمستقيم 3D ثقافة الخلية ذوبان الجليد التي شنت على شريحة ITO المغلفة للتصوير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. ممثل النتائج من جزيء صغير MALDI-MSI من قسم الاستوائي ثقافة خلية 3D. الأعلى) متوسط ​​أطياف الشامل يتحقق مع α-CHCA في نطاق انخفاض كتلة (جزيء صغير). القاع) الصور التمثيلية للكتلة واحدة: 327.8 م / ض محلية في المقام الأول إلى المناطق الداخلية من زراعة الخلايا 3D و429.7 م / ض محلية في المقام الأول إلى حافة ثقافة الخلية 3D. خط متقطع يدل على حافة التقريبية للكروي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. ممثل النتائج من التصوير البروتين MALDI-MSI من قسم الاستوائي ثقافة خلية 3D. الأعلى) متوسط ​​أطياف الشامل يتحقق مع حمض sinapic في أعلى (المدى البروتين) كتلة. أسفل) صور الممثل من كتلة واحدة: 10871 م / ض محلية في المقام الأول إلى حافة كروي، و12184 م / ض محلية أكثر نحو المناطق الداخلية من كروي. خط متقطع يدل على حافة التقريبية للكروي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

باستخدام الأساليب المذكورة أعلاه، قد تكون نمت مزارع الخلايا 3D وتحليلها مع MALDI-MSI. وكثير من خطوط الخلايا خلد تشكيل هياكل 3D عندما مثقف بشكل مناسب. وينبغي اتخاذ 9،10 العناية لزراعة الخلايا التي لم يتم مرت مرات كثيرة جدا، وهذا هو، لديهم أرقام مرور منخفضة. بشكل عام، والخلايا مع أرقام مرور عشر وأقل هي الأمثل لزراعة مزارع الخلايا 3D. نموا في مزارع الخلايا 3D في دعم الاغاروز التقليدي يوفر وسيلة فعالة من حيث التكلفة لمجموعات بحثية مهتمة في زراعة الخلايا 3D لمحاولة هذا النظام. هذه الطريقة تستخدم بعض المكونات لم تكن بالفعل في معظم المختبرات زراعة الخلايا الثديية. ويجب إيلاء اهتمام دقيق لإعداد لوحات الاغاروز للنمو بحيث مزارع الخلايا 3D تتفق في الحجم والشكل. وتشمل بعض الجوانب التي تتطلب عناية فائقة التحقق من أن عدم وجود فقاعات الهواء هي شرك إلى الخليط وأن يتم تشكيل الغضروف المفصلي السليم في الجزء السفلي من كل ثالذراع. إذا لم تشكل الغضروف المفصلي بشكل صحيح، فإن الخلايا قد تنمو في أشكال غير كروي أو في كتل صغيرة. أيضا، يجب الحرص على عدم وضع PBS في الجيلاتين مع الأجسام الشبه الكروية. إذا حدث هذا، إزالة برنامج تلفزيوني من الجزء العلوي من الجيلاتين باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. إذا كانت التكلفة ليست عاملا، منخفضة للغاية لوحات مستديرة أسفل ملزمة هي تجاريا المتاحة وتقدم تبسيط هذه الخطوات. في حين أساليب تضمين الأنسجة الأخرى يمكن أيضا أن تكون مكلفة وغير الشامل الطيف متوافق، وقد تبين الجيلاتين التضمين على حد سواء غير مكلفة وتنوعا. وقد تم تحسين استراتيجيات إعداد المبينة أعلاه لمزارع الخلايا 3D للحصول على أعلى جودة البيانات. في حين فقد تبين الجيلاتين التضمين لتكون متوافقة مع تحليل الطيف الكتلي، وهذه العملية تضيق المصفوفات المتاحة بسبب شارك في التبلور. مرة واحدة المجمدة، ومزارع الخلايا 3D مستقرة لعدة أشهر طالما لم يتم إذابة تجميد هم. الجيلاتين تصبح معتمة عندما المجمدة، والخلية 3Dالثقافات هي من لون مشابه، لذلك فإنه من المستحسن قبل التجميد لتوثيق 3D ثقافة الخلية التنسيب للمساعدة في تشريح.

عند إعداد الشرائح، مصفوفة يمكن تطبيقها مع عدة طرق مختلفة، ولكن تجدر الإشارة إلى أن بعض مصفوفات تم العثور على المشاركة في crystalize مع الجيلاتين، مثل حمض الفيرليك، مما يجعل عينة غير صالحة للاستعمال. بلورات المصفوفة أصغر تنتج أكثر اتساقا أطياف الكتلة. في حين handspotting هو أبسط طريقة لتطبيق مصفوفة، يمكن للحجم المذيب أكبر يؤدي إلى أحجام أكبر وضوح الشمس والهجرة تحليلها كبيرة.

في مطياف الكتلة، والتقدم في التقنيات MALDI-MSI قد قلل من الخبرات اللازمة لتحلل البداية. الحصول على البيانات وتحليل واضح ومباشر على معظم أنظمة، مما يسمح حتى المبتدئ الحصول على معلومات ذات جودة عالية من الشرائح ITO المغلفة. الاختيار الدقيق للالمعلمات الصك، الأمثل على المجاورة غير صورة 3D يستحق خلية الثقافيهوفاق، أمر بالغ الأهمية لحصول على بيانات عالية الجودة. على سبيل المثال، وزيادة قوة الليزر قد تزيد من كثافة الذروة ولكن تقليل قوة الليزر قد يحسن القرار، وإعطاء الأشكال الذروة أكثر توازنا. مزارع الخلايا 3D ينبغي أن تستخدم بسرعة تشريح لضمان أفضل جودة العينة بعد. ويمكن اعتبار تدهور إشارة البروتين في أقل من أسبوع دون التخزين السليم (dessicator ل/ -80 ° C الفريزر)، وخاصة في المنطقة الجماهيرية العالية (فوق 20 كيلو دالتون). بسبب الطلب المتزايد، تم وضع العديد من البرامج المختلفة والتصور أحرار للجمهور البحوث. وتثبيت معظم الطيف كتلة التصوير البرامج اللازمة لتصور الجماهير واحدة مع صيغ الملفات الخاصة المستخدمة في كل وثيقة. ويمكن استخدام هذه البرامج للحصول على صور واحدة كتلة وتصدير البيانات. ومعظم البرنامج أيضا يسمح للتراكب من اثنين أو أكثر من جماهير الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، الكثير من المشاهدين مختلفة للبيانات MSI لتحميل خالية، مثل MSiReader لد BioMap. 32،33 البيانات مطياف الكتلة التي تم الحصول عليها كما يمكن معالجتها في مرحلة ما بعد الاستحواذ بكل سهولة، وبذلك المزيد من المعلومات المفيدة الى الواجهة.

من الأدوية إلى الدهون للبروتينات، ونظام المذكورة أعلاه يسمح لاقتناء السريع للبيانات لتقييم توزيع جزيئات من الفائدة عبر هيكل زراعة الخلايا 3D. يمكن أن تؤخذ أقسام التسلسلية لصورة هيكل 3D بأكمله من خلال بناء من كل صورة 2D من شريحة من ثقافة الخلية 3D. سوف التقنيات والملاحظات في البروتوكول أن تكون ذات فائدة للباحثين الذين يرغبون في بدء زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد كجسر بين الثقافة أحادي الطبقة والنماذج الحيوانية. مرة واحدة يتقن هذه التقنيات يمكن تطبيقها على أنواع متعددة من الثقافات 3D الخلية والأنسجة، والمستنبتات الخلوية، مما يتيح للباحثين صورة أيهما العينات التي تختارها.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HCT116 Cell line ATCC ATCC CCL-247 Potential hazard, handle with care
McCoy's 5A media Gibco 16600-108
Fetal Bovine serum HyClone SH30071.03
0.25% Trypsin-EDTA solution Gibco 25200-056
Agarose Sigma-Aldrich A9539
Phosphate Buffered Saline Gibco 10010049
Gelatin, unflavored Knox Available at most grocery stores in single-packets
ITO-coated glass slides Delta Technologies, Limited CG-90IN-S115
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)  Sigma-Aldrich C8982
Sinapic Acid Sigma-Aldrich 85429
0.3 mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set RoyalMax Airbrush Many options available on sites such as Amazon.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., Römpp, A. Single cell matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging. Anal Chem. 84 (15), 6293-6297 (2012).
  2. Cornett, D., Frappier, S., Caprioli, R. MALDI-FTICR imaging mass spectrometry of drugs and metabolites in tissue. Anal Chem. 80 (14), 5648-5653 (2008).
  3. Reyzer, M. L., Hsieh, Y., Ng, K., Korfmacher, W. a, Caprioli, R. M. Direct analysis of drug candidates in tissue by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. J Mass Spectrom. 38 (10), 1081-1092 (2003).
  4. Reyzer, M. L., Chaurand, P., Angel, P. M., Caprioli, R. M. Direct molecular analysis of whole-body animal tissue sections by MALDI imaging mass spectrometry. Methods Mol Biol. 656 (18), 285-301 (2010).
  5. Cornett, D., Reyzer, M., Chaurand, P., Caprioli, R. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat Methods. 4 (10), 828-833 (2007).
  6. Guenther, S., et al. Histology by mass spectrometry: label-free tissue characterization obtained from high-accuracy bioanalytical imaging. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (22), 3834-3838 (2010).
  7. Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Molecular imaging by mass spectrometry--looking beyond classical histology. Nat Rev Cancer. 10 (9), 639-646 (2010).
  8. Kunz-Schughart, L. a, Kreutz, M., Knuechel, R. Multicellular spheroids: a three-dimensional in vitro culture system to study tumour biology. Int J Exp Pathol. 79 (1), 1-23 (1998).
  9. Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. a Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).
  10. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat Protoc. 4 (3), 309-324 (2009).
  11. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  12. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  13. Fernandes, T. G., Kwon, S. -J., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
  14. Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).
  15. Weaver, E. M., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures. Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).
  16. Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Anal Chem. 83 (22), 8794-8801 (2011).
  17. Liu, X., Weaver, E. M., Hummon, A. B. Evaluation of Therapeutics in Three-Dimensional Cell Culture Systems by MALDI Imaging Mass Spectrometry. Anal Chem. 85 (13), 6295-6302 (2013).
  18. Ahlf, D. R., Masyuko, R. N., Hummon, A. B., Bohn, P. Correlated Mass Spectrometry Imaging and Confocal Raman Microscopy for Studies of Three-Dimensional Cell Culture Sections. Analyst. 139 (18), 4578-4585 (2014).
  19. Derda, R., Tang, S. K. Y., et al. Multizone paper platform for 3D cell cultures. PloS one. 6 (5), 18940 (2011).
  20. Imbeault, S., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. aL. Localizing protein in 3D neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology. J Vis Exp. 2 (46), 2-7 (2010).
  21. He, W., Kuang, Y., et al. Proteomic Comparison of 3D and 2D Glioma Models Reveals Increased HLA-E Expression in 3D Models is Associated with Resistance to NK Cell-Mediated Cytotoxicity. J Proteome Res. 13 (5), 2272-2281 (2014).
  22. Chen, R., Cape, S. S., Sturm, R. M., Li, L. Mass Spectrometric Imaging of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues. Methods Mol Biol. 656, 451-463 (2010).
  23. DeKeyser, S. S., Kutz-Naber, K. K., Schmidt, J. J., Barrett-Wilt, G. A., Li, L. Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues. J Proteome Res. 6 (5), 1782-1791 (2007).
  24. Van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Fornai, L., Glunde, K., Heeren, R. M. An alternative paper based tissue washing method for mass spectrometry imaging: localized washing and fragile tissue analysis. J Am Soc Mass Spectrom. 22 (10), 1885-1890 (2011).
  25. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix Sublimation/Recrystalization for Imaging Proteins by Mass Spectrometry at High Spatial Resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2012).
  26. Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections. J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).
  27. Gemperline, E., Li, L. MALDI-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in Medicago truncatula root nodules. J Vis Exp. 1 (85), 1-11 (2014).
  28. Deutsch, E. mzML: a single, unifying data format for mass spectrometer output). Proteomics. 8 (14), 2776-2777 (2008).
  29. Pedrioli, P. G. a, Eng, J. K., et al. A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research. Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).
  30. Lin, S., Zhu, L., Winter, A., Sasinowski, M., Kibbe, W. What is mzXML good for. Expert Rev Proteomics. 2 (6), 839-845 (2005).
  31. Orchard, S., Hoogland, C., Bairoch, A., Eisenacher, M., Kraus, H. -J., Binz, P. -A. Managing the data explosion. A report on the HUPO-PSI Workshop. August 2008, Amsterdam, The Netherlands. Proteomics. 9 (3), 499-501 (2009).
  32. Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. a, Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J Am Soc Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).
  33. Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides 3D volume reconstruction. Nat Methods. 5 (1), 101-108 (2008).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 94، زراعة الخلايا 3D، مطياف الكتلة، والتصوير، وزراعة الخلايا، وإعداد العينات، الأجسام الشبه الكروية
عينة استراتيجيات التحضير للتصوير الطيف الكتلي لل3D الثقافة خلية نماذج
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahlf Wheatcraft, D. R., Liu, X.,… More

Ahlf Wheatcraft, D. R., Liu, X., Hummon, A. B. Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models. J. Vis. Exp. (94), e52313, doi:10.3791/52313 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter