Monstervoorbereiding Strategieën voor massaspectrometrie Imaging van 3D celkweekmodellen

1. 3D-Cell Cultuur en voorbereiding voor Beeldvorming

1. Cultuur een geschikte cellijn, dat wil zeggen, HCT116 coloncarcinoom cellijn, in tweedimensionale, monolaagcultuur.
2. Groeien HCT 116-cellen in een T-25 kolf met McCoy's 5A medium + 10% foetaal runderserum in een 5% _CO2 incubator tot 50-70% confluentie, wat gewoonlijk een paar dagen.
3. Vrijgeven cellen met 0,25% trypsine-EDTA-oplossing en tellen van een deel van de cellen met een hemocytometer en trypan blauw kleuring te controleren celdichtheid en levensvatbaarheid.
4. Na telling verdunnen cellen met compleet medium om een ​​passende zaaidichtheid van 6000 cellen bereiken / putje of 30.000 cellen / ml.

2. Bereid Agarose Coated 96 putjes

1. Voeg 0,19 g agarose tot 10 ml van standaard media in een 50 ml conische buis (1,5% agarose-oplossing in de media) ^10. Zorgen voor opneming door voorzichtig mengen. Autoclaaf de agarose in een waterbadgedurende 20 min.
2. Met behulp van een multichannel pipet, aspireren 50 ul van de agar + media mengsel in de 60 centrale putjes van de platte bodem 96 wells plaat cultuur plaat. Aangezien de putjes omtreksranden van de plaat hebben iets hogere verdamping, voeg 200 ul 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in plaats van de agarose aan deze randen.
3. Nadat de agarose mengsel is toegevoegd aan de binnenste putjes, zet de plaat opzij afkoelen tot 37 ~ ° C vóór de toevoeging van de cellen.

3. Zaad en hebben de neiging de Driedimensionale Cultuur

OPMERKING: Meer of minder cellen worden gezaaid afhankelijk van de vereisten van de cultuur betrokken, maar er is vastgesteld dat deze omstandigheden leiden tot 3D celkweek structuren van ongeveer 1 mm in diameter na 10-14 dagen kweken (data niet getoond) .

1. Voeg 200 ul van de juiste cel-oplossing (verdund tot ~ 6000 cellen bevatten) bij de agarose gecoatePlaat met 96 putjes. Bedek de plaat en in bevochtigde incubator met 5% _CO2 bij 37 ° C voor celgroei.
2. Verander celmedia minste elke 48 uur, of wanneer de media lijkt te verkleuren.
   1. Verander media door voorzichtig opzuigen oude media van rond de kleine 3D celkweek (met het blote oog per dag 2) aan de onderzijde van de agarose. Voeg 200 ul vers medium voorzichtig over de 3D celkweek.
   2. (Optioneel) Tijdens deze media veranderingen, chemotherapeutica of andere drugs toe te voegen voor het testen. Verdun het middel van keuze voor de eindconcentratie met compleet medium en voeg de vereiste 200 ul aan elk putje.
   3. Monitor 3D celkweek groei door optische microscoop, totdat de 3D celculturen ongeveer 1 mm in diameter.

4. De Oogst van de 3D-Cell Cultures

1. Gebruik een 2 ml serologische pipet om verwijder voorzichtig de 3D-celkweek uit de agarose bed.
<li> Was de 3D celculturen met PBS door ze zachtjes pipetteren in ongeveer 1 ml PBS in een wachtstand 24 wells plaat.
2. Transfer geoogst 3D celculturen via serologische pipet om centrifuge buizen voor eiwit of metaboliet extractie, of insluiten in een cutting medium om te helpen bij het snijden voor grafische toepassingen.

5. Integreer de 3D-Cell Cultures in Gelatine

1. Bereid een oplossing van ~ 175 mg / ml gelatine in zuiver water (18 MQ voorkeur). ^22,23 Meng de gelatine krachtig. Houd u aan de oplossing steeds viskeuze en moeilijk te manipuleren. Plaats de gelatine bevattende conische buis in een waterbad bij -60 ° C en warm tot de oplossing helder en gemakkelijk te aspireren.
   OPMERKING: De warme gelatineoplossing hardt snel het afkoelt, dus moet de volgende stappen snel vóór het invriezen.
2. Nadat het wordt verwarmd, neemt de gelatine onmiddellijk aan de celkweek kap. Houd de tube met gelatine in een beaker met voorverwarmde water van ongeveer 60 ° C verharding van de gelatine-oplossing te voorkomen.
3. Met behulp van een 2 ml serologische pipet, stort 0,6 ml van de warme gelatine-oplossing in de put van een 24 platte bodem plaat. Deze hoeveelheid is voldoende om de bodem in een dunne laag bedekken. Voorzichtig deponeren 3D celculturen direct bovenop de gelatinelaag met een andere 2 ml pipet te voorkomen breken de 3D structuur.
   OPMERKING: Zorg moet worden genomen in dit stadium niet PBS te plaatsen in de gelatine. Als dit gebeurt, worden verwijderd door de PBS uit de top van de gelatine met 200 ul pipet.
4. Na de 3D celculturen op het oppervlak van de gelatinelaag geplaatst, nauwkeurig pipet een 0,6 ml warme gelatine mengsel over de 3D celculturen, teneinde de positie van de kweken niet storen. Nadat de tweede laag wordt aangebracht, invriezen-gelatine ingebedde 3D celculturen bij -80 ° C.

6. Bak en Thaw Mount the Gelatine-geïntegreerde 3D-Cell Cultures for Mass Spectrometrische Imaging

1. Verwijder de 24 wells plaat met de 3D celculturen uit de vriezer. Verwarm de onderkant van de plaat met de warmte van je hand tot een pincet of een scalpel voorzichtig zal glijden langs de zijkant van de put.
2. Soepel schuif de pincet of scalpel, het vrijmaken van de gelatine zonder ontdooien van het centrum. Neem een ​​druppel water op de cryostaat ondersteunen en gebruiken om de gelatine schijf aan de drager hechten.
   1. 3D celculturen ingebed in gelatine meest vatbaar voor snijden bij -30 ° C. Reinig de cryostaat mes en glas met 70% ethanol voor gebruik. Gebruik een ander deel van het blad of een nieuw blad voor elke 3D celcultuur gelatine schijf voorkomen mat van het blad.
3. Met behulp van de cryostaat, zacht gezicht af van de overtollige gelatine totdat de 3D celculturen zichtbaar worden.
4. Op dit punt langzaam snijd de 3D celculturen met een vloeiende beweging in 12-16 micrometer secties.
   OPMERKING: Kritische factoren snijden onder de afstand van het glas op het blad, de bladhoek, de temperatuur van de cryostaat en de hoek van de schijf op de drager, zodat al deze moet worden gecontroleerd om consistente resultaten te waarborgen.
5. Dooi zorgvuldig de plakjes en monteer ze op indium titanium oxide (ITO) -beklede glasplaatjes gepaste label en bewaar het in een exsiccator. Gebruik de plakjes zo snel mogelijk maximale kwaliteit.

7. Matrix Toepassing en Monstervoorbereiding voor MALDI Imaging

1. Voorafgaand aan MALDI imaging, bereiden plakjes met de geschikte matrix.
   1. Voor kleine molecule analyse worden geen wasstappen algemeen vereist. Voor intacte eiwit detectie, wassen de plakjes in koude 100% aceton, Carnoy's vloeistof, of 70% / 95% isopropanol om kleine moleculen te verwijderen zoals lipiden dat het signaal zou kunnen maskeren ^24-26.
   2. Voorzichtig wassen niet langer dan 30 seconden per keer. Niet doenelke plakjes verstoren.
2. Bereid matrix in een oplossing van organisch oplosmiddel en water, met 0,1% TFA. Voor kleine moleculen zoals α-cyaan-4-hydroxykaneelzuur (CHCA), gebruikt 60% ACN: 40% _H2O: 0.1% TFA (10 mg / ml). Voor proteindetectie zoals sinapinezuur (30 mg / ml), gebruiken hetzelfde oplosmiddel oplossing. Voor optimale oplosbaarheid van de sinapinezuur, oplossen eerst in acetonitril voor toevoeging van TFA: _H2O oplossing. Andere matrices kunnen dienovereenkomstig toegepast.
   OPMERKING: Matrix kan met verschillende methoden, maar opgemerkt sommige matrices werden gevonden samen kristalliseren met gelatine, zoals ferulinezuur, waardoor het monster onbruikbaar. Kleinere kristallen produceren consistenter massaspectra, waardoor meer moleculaire species te detecteren en toegeschreven aan biologische verschillen dan matrix effecten.
3. Solliciteer matrix door handspotting methode.
   1. Gebruik een fijne tip spuit tot 0,5 pl van de matr toepassingix oplossing op de 3D celkweek segment en laat de matrix kristalliseert.
4. U kunt ook gebruik maken van de airbrush methode. Vul een commerciële kwaliteit airbrush met de matrix oplossing.
   1. Houd de spuit 8-12 centimeter afstand van de glijbaan, streven een fijne nevel op het schijfje. Tussen passen, kan de matrix drogen gedurende 1 min, teneinde de beste kristalvorming. Tot 10-20 doorgangen van de airbrush moet een optimaal laag van matrix ²² produceren.
5. U kunt ook de sublimatie methode elders beschreven. ^25,27
6. Droge objectglaasjes in een exsiccator gedurende ten minste 30 min voor MALDI-MSI, ongeacht de wijze van toepassing matrix. ²⁵

8. MALDI-MSI analyse met behulp van een MALDI-TOF System (dwz AUTOFLEX III)

OPMERKING: Deze sectie bevat instructies en adviezen voor het instellen van parameters voor een MALDI-TOF beeldvorming experiment. Afhankelijk van de instrument fabrikant en software die wordt gebruikt, kan het proces variëren.

1. Plaats de dia's in een adapter gemaakt tot 75 mm x 25 mm dia's veilig te houden op de foto om de 3D-celkweek plakjes gehecht aan ITO-gecoate glaasjes. Laad de dia-adapter in het instrument.
2. Bereid het instrument voor MALDI-MSI door het selecteren van een geschikte kalibratie standaard voor de massa-range in kwestie. Bij ondervraging van kleine moleculen, de gedetecteerde signalen die overeenkomen met de gebruikte matrix, α-CHCA, één gemeenschappelijke blok van ijkmiddelen. Voor analyse van eiwitten, zijn bekend eiwitstandaarden (dwz ubiquitine, trypsinogeen) in het massabereik van belang geselecteerd en gespot naast de 3D ​​celculturen als ijkmiddelen. Het instrument kalibreren voordat u doorgaat met de ontwikkeling van methodes.
3. Vóór beeldvorming, data-acquisitie werkwijzen voor het massabereik van keuze gebruik van de software die door de fabrikant van het instrument. Zie Figuren 1 en 2 voormoleculen en eiwitten beeldvorming. Voor kleine molecule beeldvorming, gebruiken reflectron-modus voor de hoogste massa resolutie.
   1. Pas de massa bereik voor kleine molecule data-acquisitie tussen 100-1000 m / z en voor eiwitten tussen 8.000 25.000 m / z. Pas de massa bereik naar de regio van keuze omvatten, terwijl het verstrekken van de hoogste massa-resolutie mogelijk met het instrument.
   2. Pas laservermogen, frequentie, aantal laser schoten en spot maat aan de hand van de kalibratie-oplossing en een nabijgelegen 'offer' 3D-celkweek slice. Neem de volgende instellingen in het belangrijkste instrument besturingssoftware. Gebruik de volgende instellingen als aanbevolen uitgangspunt: 60% vermogen, 400 laser schoten, ultra kleine spotgrootte. Deze instellingen zullen variëren over instrumenten en methoden, zodat optimaliseren instrument parameters om de hoogste kwaliteit spectra voor elk specifiek instrument te geven. Andere parameters die kunnen worden aangepast onder de detector winst, sample rate, en elektronische gewin. Save deze methode voor gebruik in de imaging software (dwz., AutoExecute Method dat FlexImaging zal putten).
      OPMERKING: Onderdruk ionen onder het massabereik van belang (teruggevonden in het controlemiddel) om niet interfereert met detectie.
   3. Ontwikkelen eiwit data-acquisitie methoden voor het massale aanbod van keuze. Volg dezelfde stappen hierboven beschreven, maar voor de mid-to-high massa bereiken, boven ongeveer 3 kDa, gebruiken lineaire modus.
      OPMERKING: De instellingen zullen verschillen van die welke worden gebruikt voor kleine molecule methoden.
4. Setup specifieke MS instrument parameters met de imaging software die door de fabrikant van het instrument, zoals FlexImaging voor Bruker MALDI-TOF-systemen.
   1. Maak een nieuwe beeldvorming van bestanden en mappen, met behulp van de voorafgaande ontwikkeld en opgeslagen methoden. Selecteer de parameters instrument zoals raster spotgrootte (verandering ten opzichte van de standaard ongeveer 200 pm tot 50 pm), het opzetten van het instrument besturingsmethode (setup in stap 8.3.2 of 8.3.3), en positie waar te scannen via het 3D-celkweek.
   2. Selecteer drie geschikte teach punten op het monster, het verplaatsen van de laser om elk op hun beurt. Het verkrijgen van de optische foto van de MALDI-TOF laser controle software met behulp van 'print screen'.
      OPMERKING: Veel imaging software vereisen een optische foto van het monster "leren" van de software waarmee de laser zich bevindt, kan worden verkregen met een scanner of vaak instrument camera.
5. Dan beginnen de beeldvorming proces van de imaging software (niet de controle-instrument) en het verwerven van massa spectra van elk segment. Observeren de meeste massa's over de 3D-celkweek en anderen gelokaliseerde naar bepaalde gebieden.

9. Optioneel Data Analyse Methoden

1. Voor gerichte analyse uit te voeren handmatige analyse van de spectra door te klikken op een mis in de gemiddelde spectrum, of toestaan ​​dat de imaging software om automatisch met massa's boven een bepaalde drempel (bijv., Pieken above de top 20% -drempel). Voor kwaliteitscontrole, onderzoekt de distributie van matrix pieken of het gemiddelde spectrum.
2. Uit te voeren statistische analyses met gewonnen datasets in wiskundige software zoals R of Matlab.
   1. Export enkele spectra in ASCII-formaat, een leesbaar tekstbestand, voor het laden in de software van de keuze.
   2. Zetten de individuele spectra naar ASCII, mzXML, van mzML formaat voor het lezen door verschillende softwareprogramma's, ^{28 -. 31} of de gegevens te exporteren als een Analyseren (.img) formaat bestand, een gemeenschappelijk formaat gebruikt voor andere beeldvormende toepassingen zoals MRI ³² twee open-source mogelijkheden voor analyse zijn MSiReader en BioMap ^32,33.
   3. Zodra de bestanden worden geëxporteerd naar een formaat dat leesbaar is door de software, laadt de dataset via de instructies in de desbetreffende software. Na het laden, uit te voeren na de overname verwerking, zoals de basislijn verwijdering en normalisering.
   4. Met deze dataset, stati voerenstical behandelingen zoals belangrijkste analyse van hiërarchische clustering met behulp van aangepaste scripts of ingebouwde algoritmen in software zoals Matlab ¹⁸ component.

MSI beeldvorming heeft de potentie om veel verschillende moleculaire verdeling in 3D celculturen onthullen. Met de hierboven beschreven werkwijze, kunnen species van kleine moleculen (Figuur 1) tot grote eiwitten (figuur 2) wordt gevolgd in de cultuur. Deze resultaten tonen visualisatie van een ion met een gratis tool MSiReader. ³² De resultaten kunnen worden geanalyseerd voor enkelvoudige ionen van belang in de 3D ​​celkweek visualisatie software zijn in een gebied van belang of het volledige gescande gebied. Daarnaast meeste software zal automatisch visualiseren ionen boven een bepaalde drempel door de gebruiker, die ontdekking inspanningen kan helpen in te stellen. Zodra enkele ion kaarten worden verkregen, de meeste software bevat een mogelijkheid om de beelden elkaar te leggen om de colokalisatie van ionen te bekijken. Hetzij in discovery-gebaseerde benaderingen of op een gerichte manier, massaspectrometrie imaging is een krachtige tool om 3D celculturen te analyseren.

Figuur 1. Representatieve resultaten van 3D-celkweek groei en snijden. Links) Optische beeld van een intacte colorectale HCT-116 3D-celkweek structuur gezien op dag 14 vóór de oogst. Rechts) Optisch beeld van een ongeveer equatoriale plak van een colorectale 3D-celkweek dooi gemonteerd op een ITO-gecoate glijbaan voor de beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2. Representatieve resultaten van kleine molecule MALDI-MSI van een dwarsdoorsnede van een 3D-celkweek. Top) Gemiddeld massa spectra bereikt met α-CHCA in de lage massa (kleine moleculen) bereik. Onderkant) Vertegenwoordiger beelden vanéén massa: 327,8 m / z hoofdzakelijk gelokaliseerd in het inwendige van de 3D-celkweek en 429,7 m / z voornamelijk gelokaliseerd in de rand van de 3D ​​celkweek. Gestippelde lijn geeft de geschatte rand van de bolvormige. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3. Representatieve resultaten van eiwit beeldvorming door MALDI-MSI van een dwarsdoorsnede van een 3D-celkweek. Top) Gemiddeld massa spectra bereikt met sinapinezuur in de hogere (eiwit) massa bereik. Onder) Representatieve beelden van een enkele massa: 10.871 m / z voornamelijk gelokaliseerd in de rand van de sferoïde en 12.184 m / z gelokaliseerd meer naar het inwendige van de sferoïde. Gestippelde lijn geeft de geschatte rand van de bolvormige. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Met de hierboven beschreven methoden kan 3D celculturen worden gekweekt en geanalyseerd met MALDI-MSI. Veel geïmmortaliseerde cellijnen 3D structuren vormen wanneer gekweekt juiste. ^9,10 Wees voorzichtig dat cellen niet te vaak gepasseerd, dat wil zeggen lage passage nummers cultiveren. In het algemeen cellen met passage nummers van tien lager zijn optimaal voor groeiende 3D celculturen. Groeit de 3D celculturen in een traditionele agarose-ondersteuning biedt een kosteneffectieve manier voor onderzoeksgroepen die geïnteresseerd zijn in 3D celcultuur om dit systeem te proberen. Deze werkwijze gebruikt weinig componenten niet reeds in de meeste zoogdierlijke celkweek laboratoria. Zodat de 3D celculturen zijn consistent in grootte en vorm zorgvuldige aandacht moet worden besteed aan de voorbereiding van de agar platen voor groei; sommige aspecten die aandacht behoeven zijn het controleren dat geen luchtbellen ingevangen aan het mengsel en dat een goede meniscus gevormd op de bodem van elke well. Als de meniscus niet goed vormt, kunnen de cellen groeien in niet-bolvormige vormen of in kleine groepjes. Ook moet erop worden gelet niet PBS te plaatsen in de gelatine met de bolletjes. Als dit gebeurt, verwijder de PBS uit de top van de gelatine met 200 ul pipet. Als kosten geen factor, ultra-lage bindingsaffiniteit ronde bodemplaten zijn in de handel verkrijgbaar en bieden vereenvoudiging van deze stappen. Terwijl andere weefsel inbedding methoden ook duur en niet-massaspectrometrie compatibel zijn, heeft gelatine-embedding aangetoond zowel goedkoop en veelzijdig. Bereiding aangeduide strategie zijn geoptimaliseerd voor 3D celculturen om de hoogste kwaliteit gegevens. Terwijl gelatine-embedding is verenigbaar gebleken met massaspectrometrie analyse zijn dit proces doet smal de beschikbare matrices door co-kristallisatie. Eenmaal bevroren, 3D celculturen stabiel maanden zolang ze niet bevroren en ontdooid. De gelatine wordt ondoorzichtig als bevroren, en de 3D-celculturen van dezelfde kleur, dus is het raadzaam voor het invriezen van de 3D celkweek plaatsing te helpen bij snijden document.

Bij de voorbereiding slides kunnen matrix worden aangebracht met verschillende methoden, maar dient te worden opgemerkt dat sommige matrixen zijn gevonden samen kristalliseren met gelatine, zoals ferulinezuur, waardoor het monster onbruikbaar. Kleinere matrix kristallen produceren meer consistente massa spectra. Terwijl handspotting is de eenvoudigste methode matrix verzoek de grotere oplosmiddelvolume resulteren in grotere kristalgrootte en significante analyt migratie.

Op de massaspectrometer, voorschotten in MALDI-MSI technologieën die nodig zijn voor begin analyseert deskundigheid hebben verminderd. Data-acquisitie en analyse is eenvoudig op de meeste systemen, zodat zelfs een beginner tot hoogwaardige informatie van ITO-gecoate glaasjes te verkrijgen. Zorgvuldige selectie van de parameters instrument, geoptimaliseerd op nabijgelegen niet-image waardig 3D cell cultures, is van cruciaal belang voor het verkrijgen van gegevens van hoge kwaliteit. Door bijvoorbeeld de laservermogen kan piek intensiteit te verhogen maar verlagen laservermogen kan de resolutie te verbeteren en geven meer symmetrische piekvormen. 3D celculturen moet snel worden gebruikt na het snijden om een ​​optimale kwaliteit van het monster te garanderen. Afbraak van eiwitten signaal kan worden waargenomen in minder dan een week zonder droging (exsiccator / -80 ° C vriezer), vooral in de hoge massagebied (boven 20 kDa). Vanwege de groeiende vraag, hebben veel verschillende visualisatie software programma's ontwikkeld en zijn vrij om het onderzoek openbaar. De meeste imaging massaspectrometers hebben de software die nodig is om enkele massa te visualiseren met de eigen formaten gebruikt op elk instrument geïnstalleerd. Deze software kan worden gebruikt om één massa afbeeldingen gegevens verkrijgen en te exporteren. De meeste software zal het ook mogelijk de overlay van twee of meer massa's van belang. Daarnaast hebben veel verschillende kijkers voor MSI data zijn gratis te downloaden, zoals MSiReader eend BioMap. ^32,33 De massaspectrometrie verkregen gegevens kunnen ook worden verwerkt na de overname met gemak, waardoor meer nuttige informatie op de voorgrond.

Van geneesmiddelen aan lipiden eiwitten bovengenoemde systeem maakt een snelle acquisitie van gegevens aan de verdeling van moleculen van interesse in een 3D celkweek structuur evalueren. Seriële secties kunnen worden genomen om de de gehele 3D-structuur door gebouw uit elk 2D afbeelding van een plak van het 3D celkweek. De technieken en aantekeningen in het protocol zal van nut zijn voor onderzoekers die willen beginnen met driedimensionale celcultuur als een brug tussen monolaagcultuur en diermodellen. Eenmaal knie, kunnen deze technieken worden toegepast om meerdere 3D celculturen, weefsels en celkweken, waardoor onderzoekers beeld welke monsters zij kiezen.