Eggstokkreft celle invasjon inn i mesothelial foring av bukhule er en dynamisk prosess over tid. Utnytte en sanntidsanalysator, kan den invasiv kapasitet på eggstokkreft celler i en spheroid-mesothelial celle co-kultur modell kvantifiseres over lengre tidsperioder, og gir innsikt i faktorer som regulerer metastatisk prosess.
Eggstokkreft metastaserer ved Shedding inn i peritoneal væske og sprer seg til distale områder innenfor bukhinnen. Ettlagskulturer ikke nøyaktig modell atferd av kreftceller i et ikke-festede miljø, som kreftceller iboende samle inn flercellede strukturer som bidrar til metastatisk prosessen ved å feste til og invaderer peritoneal fôr for å danne sekundære svulster. For å modellere denne viktige fasen av eggstokkreft metastasering, flercellede aggregater, eller sfæroider, kan genereres fra etablerte eggstokkreft cellelinjer opprettholdes i henhold til ikke-festede forhold. For å etterligne peritoneal mikromiljøet som oppdages av tumorceller in vivo, ble en sfæroide-mesothelial ko-kulturmodellen etablert hvori på forhånd dannet sfæroider som er belagt på toppen av en human mesothelial cellemonosjikt, dannet over en ekstracellulær matriks barriere. Metoder ble deretter utviklet ved hjelp av en real-time celle analysator å gjennomføre kvantitativ realtidsmålinger av invasiv kapasitet på ulike eggstokkreft cellelinjer dyrket som sfæroider. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for den kontinuerlige måling av invasjon over lang tid, noe som har flere fordeler i forhold til tradisjonelle endepunkt assays og mer arbeidskrevende sanntid mikrosbildeanalyser. Kort sagt, gjør denne metoden en rask, fastsettelse av faktorer som regulerer samspillet mellom eggstokkreft sfæroide celler invaderende gjennom mesothelial og matrise barrierer over tid.
Eggstokkreft har høyest dødelighet av alle gynekologisk kreft en. På verdensbasis er det ~ 230 000 tilfeller og over 100 000 dødsfall på grunn av sykdommen hvert år en. De fleste pasienter (> 75%) er diagnostisert etter at kreften allerede har spredning når behandling er ytterligere komplisert ved økt motstand mot kjemoterapi og prognosen er dårlig to. Pasienter med stadium III-IV metastatisk sykdom har 5 års overlevelse på bare 30-40% 3. Dermed er det et presserende behov for en bedre forståelse av de cellulære atferd underliggende eggstokkreft metastasering for effektivt å behandle avansert sykdom.
Den aktuelle modellen av ovarial cancer metastase foreslår flere trinn i metastatisk prosess, hvor hver av disse forekommer i en distinkt mikromiljøet hvilke virkninger på tumor oppførsel. Metastasizing eggstokkreft celler i utgangspunktet er utgytt fra den primære svulsten nettstedet og overleve i en nonadherent stat i peritoneal væske som enkeltceller eller tredimensjonale flercellede strukturer, kalt flercellede tilslag eller sfæroider 2,4,5. Celler som ikke danner sfæroider i suspensjonen er mer utsatt for anoikis 2,4,5. Sfæroider fremviser også økt motstand mot kjemoterapeutika, bidrar til restsykdom og påfølgende tilbakefall av kreft 2,4,5. Et annet kritisk punkt i eggstokkreft metastasering er overgangen av aggregater fra frittflytende klynger til etablerte sekundære svulster i bukhinnen og omentum 5,6. Celle-celle og celle-substrat interaksjoner har vært innblandet i aggregatdannelse, overlevelse, og tilslutning til den ekstracellulære matrix (ECM) produsert av mesothelial foring av bukhule 4-11. Som ennå, er disse prosessene dårlig forstått.
Å definere de mekanismene som er involvert i formidling av eggstokkreft, kan sfæroider være genererte fra etablerte kreftcellelinjer ved hjelp av ikke-festede kultur metoder, vedlikeholde celler i suspensjon enten ved å legge methylcellulose til kultur media 12,13 eller ved dyrkning celler på lav-festeplater 2,14. Når dyrket på denne måte, eggstokkreft celler montere inn flercellede aggregater eller sfæroider som oppviser tilsvarende cellulære, molekylære og biokjemiske egenskaper til de av tumor aggregater funnet in vivo 2,14. Etter dannelse kan sfæroider blir deretter høstet fra adherente medium og replated mot en rekke faste overflater for ytterligere funksjonelle studier. Dette representerer et fremskritt i forhold til assays i monosjikt kultur, som ikke nøyaktig modell atferd av eggstokkreft celler metastasizing innenfor et ikke-adherente miljø slik som intraperitoneal fluid.
Den invasiv kapasitet på kreft sfæroider kan vurderes i tradisjonelle endepunkt analyser i Boyden kamre 2 </sup>, men denne tilnærmingen kan være misvisende, som eggstokkreft celle invasjon er en dynamisk prosess over tid. En fersk sanntid metoden har blitt utviklet ved hjelp av time-lapse video mikroskopi av mesothelial celle avklaring fra invaderende eggstokkreft sfæroider 15,16; derimot, er analyse av tidsintervalldata tidkrevende og kan være subjektiv. Heri, er en rask, kvantitativ metode for å vurdere de invasive atferd av eggstokkreft sfæroider i sanntid beskrevet. For det første ble en spheroid-mesothelial cellemodell etablert som representerer stadium av eggstokkreft metastasering når flercellede sfæroider feste til og invadere peritoneal fôr for å danne sekundære svulster. Deretter metodikk for en Real Time Cell Analyzer (RTCA, se Materialer tabell for bedriftsinformasjon) ble tilpasset til å gjennomføre kvantitative sanntidsmålinger av invasiv kapasitet på ulike eggstokkreft cellelinjer dyrket som sfæroider og testet i denne modellen.
I RTCA iinstrument, er cellulære responser måles kontinuerlig i løpet av et assay, uten behov for eksogene etiketter, ved å måle forandringer i elektriske impedans. Spesialdesignet kultur plater har gull belagt mikroelektroder plassert under en mikro membran i skjæringspunktet mellom den øvre og nedre kammer av en to kamret godt ('CIM' plater). Plasseringen av elektrodene i det nedre kammer muliggjør måling av endringer i elektrisk impedanse som celler invaderer gjennom en ECM eller ECM / cellulær barriere. Membranen grensesnittet mellom de to kamre i hver CIM plate brønnen er først belagt med ECM-komponenten av interesse. I den sfæroide-mesothelial cellemodellsystemet, er grenseflaten belagt med et lag av Matrigel (se Materialer for selskapsbord detaljer), for å etterligne den komplekse ECM liggende mesothelial slimhinnen i peritoneum, etterfulgt av et konfluent monolag av human mesothelial ' target 'celler. Til slutt, pre-formede eggstokkreft sfæroider er annonseded. Eggstokkreft sfæroide celler må aktivt invadere gjennom målcellene lag og matrise for å nå bunnen kammer og endre elektriske impedans målinger. Målceller på egen hånd er også vurdert for å sikre at de ikke invaderer gjennom massesjikt, og er egnet for bruk i denne analysen.
Invaderende eggstokkreft celler kommuniserer med en rekke celletyper på overflaten av peritoneum, inkludert adipocytter, fibroblaster og mesothelial celler, og toveiskommunikasjon mellom kreftceller og peritoneal-celler antas å spille viktige roller i å drive den metastatisk prosess 2.. Når mestret, protokollen som beskrevet heri kan lett tilpasses til studiet av disse interaksjonene i peritoneal mikromiljøet, for eksempel, ved tilsetning av eksogene cytokiner, vekstfaktorer eller spesifikke inhibitorer mot øvre eller nedre kamre av CIM plate brønn eller genetisk manipulasjon av kreft eller peritoneale cellelinjer. Videre kan denne fremgangsmåten anvendes med primære eggstokkkreftceller høstet ferskt fra ondartede ascites og / eller primære peritoneale celler for å oppnå direkte innsikt i de regulerende signaler og cellulære interaksjoner som regulerer etableringen av en metastatisk lesjon i bukhulen <sopp> to.
Bruk av RTCA instrument for å måle invasiv kapasitet på enkeltceller eller sfæroider tilbyr flere fordeler fremfor konvensjonelle enkelt endepunkt analyser og time-lapse bildeanalyser. Den RTCA instrument måler cellulær invasjon ved definerte intervaller kontinuerlig i løpet av et assay, som kan være flere timer eller dager. Dette gjør det mulig for fastsettelse av endringer i frekvensen av invasjonen over tid, som overvinner begrensningene av enkelt endepunkt analyser. For eksempel undersøke invasjons data fra de ulike kreftcellelinjer med en enkelt endepunkt (figur 2), for eksempel, tre timer, kan ha ført til den feilaktige konklusjonen at KGN og OVCA433 celler var langt mer omfattende enn OVCA429 celler. En annen fordel med denne teknologien er at den RTCA instrument måler endringer i elektrisk impedans. Dette betyr at analyser kan kjøres uten å merke celler med et eksogent middel, som kan ha uønskede effekter på celle phenotype eller funksjon. Dette blir spesielt viktig når en skal studere primær eggstokkreft celler avledet fra maligne ascites, som det er viktig å holde manipulasjoner til et minimum, slik som å unngå å introdusere molekylære og fenotypiske endringer som ikke er reflekterende av deres in vivo natur to. Videre muliggjør bruken av RTCA instrument innsamling av kvantitative data i sann tid, noe som ikke bare unngår tidkrevende analyser forbundet med time-lapse mikroskopi, men også gjør det mulig for den raske bestemmelse av viktige eksperimentelle vinduer for assay optimalisering. Dette er spesielt nyttig når man sammenligner effekten av en rekke faktorer på spheroid invasjon, kan like forskjellige faktorer utøve sine maksimal effekt på forskjellige tidspunkter eller med sterkt forskjellige profiler over tid.
Selv om denne protokollen er mottagelig for endringer (for eksempel bruk av ulike ECM matrise, ulike kreftcellelinjer, eller forskjellige mål celvs), om å gjøre dette, er det viktig å merke seg at forskjellige eksperimentelle betingelser må først optimaliseres. For eksempel, før igangsetting studier av sfæroide invasjon, det optimale antall av kreftceller / CIM plate brønnen skal først fastslås ved analyse av celletall titreringer i monolag-kultur. Det optimale antall sfæroider som skal brukes per brønn blir deretter basert på denne analysen. For eksempel, i den aktuelle fremgangsmåte, sfæroider består av omtrent 3000 celler hver når først generert. Hvis innledende celle nummer titreringer tyder på at 30 000 celler i monolayer er optimal for deteksjon i invasjonen analyser, deretter 10 sfæroider legges per CIM plate også. Videre, når gjennomføre ko-kultur eksperimenter er det viktig å undersøke de virkemåter for den "target" cell monolayer separat for å bestemme om disse celler er iboende invasiv, da dette kan forvirre resultatene. I eksempelet vist, er kreft sfæroider belagt på toppen av en LP9 celle Monolayer, med og uten FBS lagt til bunnen samt en chemoattractant. Parallelt blir LP9 celler dyrket alene, under hver behandlingstilstand.
Tilsvarende, når man studerer invasiv antall celler og sfæroider, er det også viktig å undersøke deres trekkende kapasitet samt for å skille de to oppførsel (dvs. invasjon krever den proteolytiske nedbrytning av en ECM barriere mens migrasjon ikke). For å gjøre dette, utelater ECM barriere (Trinn 3.1.1 – 3.1.3) og gjennomføre analysen parallelt med ECM barriere på plass. Sistnevnte 'invasjon' tiltaket kan rettes til den tidligere "migrasjon" mål, hvis det er ønskelig. Til slutt er det viktig å merke seg at informasjonen oppnådd fra målinger av elektrisk impedans er begrenset i omfang når cellene har invadert inn i bunnkammeret, kan endringer i cellenes hefting, spre og spredning på undersiden av membranen bidrar til endringene i impedans readings. Derfor er denne metode mest informative når det brukes i forbindelse med andre assays av sfæroide celleviabilitet, adhesjon, migrasjon og morfologi for å omfattende vurdere sfæroide celle atferd. For eksempel, ideelt sett, for å fullt ut forstå sfæroide-mesothelial interaksjoner, separate co-kulturer bør også bli fotografert med jevne mellomrom i henhold til standard fasemikros slik at kvalitative vurderinger av spheroid morfologi og helse kan gjøres parallelt med kvantitative RTCA analyser av invasjonen. Hvis den valg merking trinnet utføres, deretter atferd av enkeltkreftceller kan bestemmes under fluorescerende mikroskopi som de disaggregate fra spheroid og samhandle med de umerkede mesothelial celler. En ekstra fordel med fluorescerende merking av kreftceller når co-dyrking med en annen celletype, er at det er mulig å bekrefte at bare kreftcellene har invadert gjennom celle og ECM barrierer.
<p class="jove_content"> I sammendraget, representerer denne metoden en høy gjennomstrømning kvantitativ analyse av eggstokkreft spheroid invasjon av mesothelial og ECM barrierer. Gjennom tilførsel av eksogene cytokiner, vekstfaktorer, eller spesifikke hemmere til de øvre eller nedre kammer av CIM plate vel, gjør at denne metoden en rask, fastsettelse av faktorer som regulerer samspillet mellom eggstokkreft sfæroide celler invaderende gjennom mesothelial og matrise barrierer i løpet tid.The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en CASS Foundation Science and Medicine Grant; (MB); en National Health & Medical Research Council of Australia Prosjekt Grant (KLS, 338 516); og ved den viktorianske regjeringens Operasjonell Infrastruktur Support Program (Australia).
xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
Methylcellulose (4000 centipose) | Sigma | M0512 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |