تقييم سرطان المبيض كروي مرفق وغزو الخلايا الظهارية في الوقت الحقيقي
Summary
غزو الخلايا السرطانية في المبيض في بطانة الظهارية الصفاق هو عملية ديناميكية مع مرور الوقت. الاستفادة من وجود محلل في الوقت الحقيقي، والقدرة الغازية من خلايا سرطان المبيض في زنزانة نموذج التعاون ثقافة كروي-الظهارية يمكن قياس مدى فترات زمنية طويلة، وتوفير نظرة ثاقبة العوامل التي تنظم عملية النقيلي.
Abstract
سرطان المبيض تنتشر من خلال تسليط داخل السائل البريتوني وتشتيت للمواقع البعيدة داخل الصفاق. الثقافات أحادي الطبقة لا نموذج بدقة السلوكيات الخلايا السرطانية ضمن بيئة غير ملتصق، والخلايا السرطانية تجميع بطبيعتها في هياكل متعددة الخلايا التي تساهم في عملية المنتشر عن طريق ربط لوغزو بطانة البريتوني لتشكيل أورام ثانوية. لنمذجة هذه المرحلة الهامة من ورم خبيث في المبيض السرطان، وحدات متعددة الخلايا، أو الأجسام الشبه الكروية، يمكن أن تتولد من المبيض خطوط الخلايا السرطانية التي أنشئت في ظل ظروف غير ملتصق المحافظة. لتقليد المكروية البريتوني عن طريق الخلايا السرطانية في الجسم الحي واجه، تم إنشاء نموذج التعاون ثقافة كروي-الظهارية التي بريفورميد ومطلي الكروية على رأس أحادي الطبقة الظهارية خلايا الإنسان، شكلت على مدى حاجز المصفوفة خارج الخلية. تم تطويرها باستخدام أساليب ثم محلل الخلية في الوقت الحقيقي لإجراء الحقيقي الكميقياسات وقت القدرة الغازية من مختلف خطوط الخلايا السرطانية في المبيض كما نمت الكروية. هذا النهج يتيح للقياس المستمر للغزو على مدى فترات طويلة من الزمن، والتي لديها العديد من المزايا أكثر من المقايسات نقطة النهاية التقليدية ويحلل أكثر شاقة صورة مجهرية الوقت الحقيقي. باختصار، وهذه الطريقة تمكن السريع، وتحديد العوامل التي تنظم التفاعلات بين الخلايا كروي سرطان المبيض من خلال غزو الظهارية ومصفوفة الحواجز مع مرور الوقت.
Introduction
سرطان المبيض لديها أعلى معدل وفيات من جميع سرطانات أمراض النساء 1. في جميع أنحاء العالم، وهناك ~ 230،000 حالات وأكثر من 100،000 حالة وفاة بسبب هذا المرض كل عام 1. ويتم تشخيص معظم المرضى (> 75٪) بعد كان السرطان قد انتشر بالفعل، عندما معقد مزيد من العلاج عن طريق زيادة مقاومة للعلاج الكيميائي والتكهن هو الفقراء 2. المرضى الذين يعانون من III-IV مرحلة المرض المنتشر لديهم معدلات البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات من 3٪ فقط 30-40. وبالتالي، هناك حاجة ملحة لفهم أفضل لسلوكيات الخلوية الكامنة المبيض سرطان ورم خبيث من أجل علاج المرض المتقدمة على نحو فعال.
النموذج الحالي من ورم خبيث في المبيض سرطان يقترح عدة خطوات في عملية المنتشر، كل الذي يحدث في المكروية متميزة مما يؤثر على سلوك الورم. الانتشار إلى خلايا سرطان المبيض في البداية يتم تسليط من موقع الورم الرئيسي والبقاء على قيد الحياة في nonadherالدولة والأنف والحنجرة في السائل البريتوني كخلايا مفردة أو متعددة الخلايا هياكل ثلاثية الأبعاد، ووصف المجاميع المتعددة الخلايا أو الأجسام الشبه الكروية 2،4،5. الخلايا التي لا تشكل الأجسام الشبه الكروية في تعليق أكثر عرضة للanoikis 2،4،5. الأجسام الشبه الكروية أيضا يحمل زيادة المقاومة لمبحث المعالجة الكيميائية، والمساهمة في مرض المتبقية وتكرار لاحقة من 2،4،5 السرطان. والخطوة الحاسمة الثانية في المبيض الانبثاث السرطان هو الانتقال من المجاميع من مجموعات التعويم الحر للأورام الثانوية التي أنشئت داخل الجدار البريتوني والثرب 5،6. قد تورطت خلية خلية وخلية الركيزة التفاعلات في تشكيل الكلي، البقاء على قيد الحياة، والتمسك المصفوفة خارج الخلية (ECM) التي تنتجها بطانة الظهارية الصفاق 4-11. حتى الآن، ولا يزال الغموض يكتنف هذه العمليات.
لتحديد الآليات التي تشارك في نشر سرطان المبيض، يمكن أن تكون الأجسام الشبه الكروية ينايرated من خطوط الخلايا السرطانية التي أنشئت باستخدام أساليب غير ملتصق الثقافة، والحفاظ على الخلايا في التعليق إما بإضافة ميثيل إلى وسائل الإعلام أو عن طريق الثقافة 12،13 زراعة الخلايا على لوحات الالكتروني المرفق انخفاض 2،14. عند تربيتها في هذه الطريقة، وخلايا سرطان المبيض التجمع في مجاميع متعددة الخلايا أو الأجسام الشبه الكروية التي تظهر الخصائص الخلوية والجزيئية والكيمياء الحيوية مشابهة لتلك التي وجدت المجاميع الورم في الجسم الحي 2،14. بعد تشكيل، الكروية يمكن حصاده في وقت لاحق من المتوسط وغير ملتصق replated على مجموعة متنوعة من السطوح الصلبة لمزيد من الدراسات وظيفية. هذا يمثل تقدما على المقايسات في الثقافة أحادي الطبقة، التي لا نموذج بدقة السلوكيات من خلايا سرطان المبيض المتفاقمة ضمن بيئة غير ملتصق مثل السائل داخل الصفاق.
القدرة الغازية من الأجسام الشبه الكروية سرطان يمكن تقييمها في المقايسات نقطة النهاية التقليدية في بويدن غرف 2 </suع>، ولكن هذا النهج يمكن أن تكون مضللة، والغزو خلية سرطان المبيض هو عملية ديناميكية مع مرور الوقت. وقد ابتكر طريقة في الوقت الحقيقي الأخيرة باستخدام الوقت الفاصل بين المجهري الفيديو إزالة الخلايا الظهارية من خلال غزو الأجسام الشبه الكروية سرطان المبيض 15،16؛ ومع ذلك، وتحليل البيانات مرور الوقت هو مضيعة للوقت، ويمكن أن يكون ذاتيا. هنا، يوصف لذلك، الأسلوب الكمي السريع لتقييم السلوكيات الغازية من الأجسام الشبه الكروية سرطان المبيض في الوقت الحقيقي. أولا، تم إنشاء نموذج الخلايا الظهارية كروي الذي يمثل مرحلة المبيض ورم خبيث السرطان عندما نعلق الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا إلى وغزو بطانة البريتوني لتشكيل أورام ثانوية. ثم منهجية لمحلل في الوقت الحقيقي الخليوي (RTCA، وانظر الجدول مواد للحصول على تفاصيل الشركة) تم تكييفها لإجراء قياسات في الوقت الحقيقي الكمي للقدرات مختلفة الغازية من خطوط الخلايا السرطانية في المبيض كما نمت الكروية واختبارها في هذا النموذج.
في RTCA فيstrument، ويتم رصد الاستجابات الخلوية بشكل مستمر على مدار مقايسة، دون الحاجة للتسميات الخارجية، عن طريق قياس التغيرات في مقاومة الكهربائية. لوحات ثقافة المصممة خصيصا لها الذهب المطلي microelectrodes يقع تحت غشاء الصغيرة التي يسهل اختراقها في واجهة بين الغرف العلوية والسفلية من 2 غرف جيدا ('CIM "لوحات). موقع الأقطاب في مجلس النواب يمكن قياس التغيرات في مقاومة الكهربائية كخلايا غزو أو من خلال ECM ECM / حاجز الخلوية. وهي مغلفة واجهة الغشاء بين الغرف 2 من كل لوحة CIM جيدا أولا مع المكون ECM من الفائدة. في النظام النموذجي خلية كروي الظهارية، وهي مغلفة واجهة بطبقة من Matrigel (انظر الجدول مواد للحصول على تفاصيل الشركة)، لتقليد ECM المعقدة الكامنة بطانة الظهارية الصفاق، تليها أحادي الطبقة الظهارية متكدسة من الإنسان ' 'الخلايا المستهدفة. أخيرا، قبل تشكيلها الأجسام الشبه الكروية سرطان المبيض هي إعلاندائرة التنمية الاقتصادية. خلايا كروي سرطان المبيض يجب أن تغزو بنشاط من خلال طبقة الخلايا المستهدفة ومصفوفة للوصول إلى غرفة أسفل وتغيير قراءات مقاومة الكهربائية. يتم تقييم الخلايا المستهدفة من تلقاء نفسها أيضا للتأكد من أنها لا تغزو من خلال طبقة مصفوفة ومناسبة للاستخدام في هذا الاختبار.
Protocol
Representative Results
Discussion
غزو خلايا سرطان المبيض التفاعل مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا على سطح الصفاق، بما في ذلك الخلايا الليفية، الخلايا الشحمية، والخلايا الظهارية، ويعتقد الاتصالات ثنائية الاتجاه بين الخلايا السرطانية والخلايا البريتوني لتلعب دورا رئيسيا في قيادة عملية النقيلي 2. مرة واحدة يتقن، وبروتوكول الموصوفة هنا هي قابلة للتكيف بسهولة لدراسة هذه التفاعلات داخل المكروية البريتوني، على سبيل المثال، من خلال إضافة السيتوكينات الخارجية، عوامل النمو، أو مثبطات محددة إلى غرف العلوي أو السفلي من لوحة CIM جيدا أو التلاعب الجيني من السرطان أو خطوط الخلايا البريتوني. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن استخدامها مع الخلايا السرطانية في المبيض الأساسي المقطوع حديثا من استسقاء الخبيثة و / أو الخلايا الأولية البريتوني للحصول على أفكار المباشر في الإشارات التنظيمية والتفاعلات الخلوية التي تحكم إنشاء الآفة المنتشر داخل التجويف البريتوني <sتصل> 2.
استخدام أداة RTCA لقياس القدرة الغازية واحد من الخلايا أو الأجسام الشبه الكروية يقدم العديد من المزايا أكثر من المقايسات نقطة النهاية واحدة التقليدية ويحلل صورة مرور الزمن. يقيس أداة RTCA الغزو الخلوية على فترات محددة باستمرار على مدار مقايسة، والتي يمكن أن تكون ساعات أو أيام. وهذا يتيح تحديد التغيرات في معدل الغزو مع مرور الوقت، والذي يتغلب على القيود المفروضة على المقايسات نقطة النهاية واحدة. على سبيل المثال، ودراسة البيانات الغزو من مختلف خطوط الخلايا السرطانية في نقطة النهاية واحدة (الشكل 2)، على سبيل المثال، 3 ساعة، قد أدت إلى الاستنتاج الخاطئ بأن KGN وOVCA433 الخلايا الغازية كانوا أكثر بكثير من OVCA429 الخلايا. ميزة أخرى لهذه التكنولوجيا هو أن الصك RTCA يقيس التغيرات في مقاومة الكهربائية. وهذا يعني أن فحوصات يمكن تشغيلها دون وصفها الخلايا مع وكيل الخارجية، والتي يمكن أن يكون لها آثار غير مقصودة على كايسي الخليةotype أو وظيفة. هذا يصبح من المهم بشكل خاص عند دراسة خلايا سرطان المبيض الأولية المستمدة من استسقاء الخبيثة، والتي لا بد من الحفاظ على التلاعب إلى أدنى حد ممكن وذلك لتجنب إدخال التغيرات الجزيئية والمظهرية التي لا تعكس في الجسم الحي طبيعتها 2. علاوة على ذلك، استخدام أداة RTCA تمكن جمع البيانات الكمية في الوقت الحقيقي، والذي يتجنب ليس فقط مضيعة للوقت التحليلات المرتبطة الوقت الفاصل بين المجهري ولكن أيضا يمكن تحديد السريع من النوافذ التجريبية الرئيسية للمقايسة الأمثل. هذا هو مفيدة بشكل خاص عند مقارنة آثار مجموعة من العوامل على غزو كروي، قد عوامل مختلفة مثل ممارسة آثارها القصوى في timepoints مختلفة أو مع ملامح مختلفة إلى حد كبير على مر الزمن.
على الرغم من أن هذا البروتوكول هو قابل للتعديلات (على سبيل المثال، استخدام مصفوفة مختلفة ECM، مختلف خطوط الخلايا السرطانية، أو مختلفة سل الهدفليرة سورية)، إذا كان ذلك، من المهم أن نلاحظ أن الظروف التجريبية المختلفة يجب أولا أن يكون الأمثل. على سبيل المثال، قبل البدء في الدراسات لغزو كروي، والعدد الأمثل من الخلايا السرطانية / CIM لوحة جيدا يجب أولا يحدده الفحص المعايرة من عدد الخلايا في الثقافة أحادي الطبقة. ثم يستند العدد الأمثل من الأجسام الشبه الكروية لاستخدام لكل بئر على هذا التحليل. على سبيل المثال، في الطريقة الحالية، تتكون الأجسام الشبه الكروية حوالي 3،000 الخلايا كل حين ولدت أولا. إذا معايرات عدد الخلايا الأولية تشير إلى أن 30،000 الخلايا في أحادي الطبقة هي الأمثل للكشف في الغزو ويحلل، ثم تضاف 10 الكروية في لوحة CIM جيدا. علاوة على ذلك، عند إجراء التجارب ثقافة مشتركة، فمن المهم لدراسة السلوكيات من 'هدف' أحادي الطبقة خلية على حدة من أجل تحديد ما إذا كانت هذه الخلايا هي بطبيعتها الغازية، وهذا يمكن أن يتغلب على النتائج. في المثال تظاهر، ومطلي الكروية السرطان على قمة monola خلية LP9ريال يمني، مع وبدون FBS تضاف إلى أسفل كذلك جاذب كيميائي. في موازاة ذلك، ومثقف الخلايا LP9 وحدها، تحت كل حالة العلاج.
وبالمثل، عند دراسة القدرة الغازية من الخلايا والأجسام الشبه الكروية، فإنه من المهم أيضا لفحص قدراتها المهاجرة وكذلك من أجل التمييز بين السلوكيات اثنين (أي الغزو يتطلب هضم بروتين من حاجز ECM حين يفعل الهجرة لا). للقيام بذلك، بحذف حاجز ECM (خطوات 3.1.1 – 3.1.3) وإجراء الفحص بالتوازي مع حاجز ECM في المكان. يمكن تصحيح 'الغزو' الإجراء الأخير إلى 'الهجرة' التدبير السابق، إذا رغبت في ذلك. أخيرا، من المهم أن نلاحظ أن المعلومات المكتسبة من التدابير لمقاومة كهربائية محدودة في النطاق: مرة واحدة قد غزت الخلايا في الغرفة السفلي، قد التغيرات في تمسكهم، ونشر، وانتشار على الجانب السفلي من الغشاء المساهمة في التغييرات في مقاومة الجرمية الضربات. وبالتالي، هذه المنهجية هو أكبر قدر من المعلومات عندما تستخدم بالاقتران مع فحوصات أخرى من الجدوى كروي الخلية، التصاق، والهجرة، والتشكل من أجل تقييم شامل السلوكيات خلية كروي. على سبيل المثال، من الناحية المثالية، من أجل التوصل إلى فهم كامل التفاعلات كروي-الظهارية، كما ينبغي تصويرها المشترك الثقافات منفصلة دوري تحت المجهر القياسية المرحلة بحيث التقييمات النوعية من مورفولوجيا كروي والصحة يمكن أن يتم بالتوازي مع المقايسات RTCA الكمي من الغزو. إذا تم تنفيذ الخطوة وضع العلامات اختياري، ومن ثم يمكن تحديد سلوك الخلايا السرطانية واحد تحت المجهر الفلورسنت لأنها تفصيل من كروي والتفاعل مع الخلايا الظهارية غير المسماة. ميزة إضافية من وصفها fluorescently الخلايا السرطانية عندما شارك مع زراعة نوع الخلية الثاني هو أنه من الممكن بعد ذلك للتأكد من أن الخلايا السرطانية فقط قد غزت من خلال الحواجز الخلية وECM.
<p class="jove_content"> باختصار، يمثل هذا الأسلوب إنتاجية عالية من التحليل الكمي المبيض غزو كروي سرطان الظهارية وECM الحواجز. من خلال إضافة السيتوكينات الخارجية، عوامل النمو، أو مثبطات محددة إلى غرف العلوي أو السفلي من لوحة CIM جيدا، وهذه الطريقة تمكن السريع، وتحديد العوامل التي تنظم التفاعلات بين الخلايا كروي سرطان المبيض من خلال غزو الظهارية والحواجز على مصفوفة الوقت.Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الاكاديمية والطب غرانت؛ (MB)؛ مجلس البحوث الصحية والطبية الوطنية في أستراليا منح المشروع (KLS، 338516)؛ وبرنامج دعم البنية التحتية التشغيلية للحكومة فيكتوريا (استراليا).
Materials
| xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
| xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
| Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
| Methylcellulose (4000 centipose) | Sigma | M0512 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
| Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
| 96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
| LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
| Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |
Referencias
- Ferlay, J., et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN. Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).
- Ahmed, N., Stenvers, K. Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
- Karst, A. M., Drapkin, R. Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution. J Oncol. 2010, (2010).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression. Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).
- Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J Transl Med. 4, 6 (2006).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers. Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).
- Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).
- Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).
- Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro. Ann Anat. 193, 181-184 (2011).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).
- Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, (2012).
- Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis. J Vis Exp. (60), (2012).
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
- Nishi, Y., et al. Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor. Endocrinology. 142, 437-445 (2001).
- Xu, F., et al. The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression. Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).
