실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가
Summary
복막의 중피 안감에 난소 암 세포의 침공은 시간이 지남에 따라 역동적 인 과정이다. 실시간 분석기를 활용 타원체-중피 세포 공동 배양 모델의 난소 암 세포의 침윤 능력은 전이 과정을 조절하는 인자에 대한 통찰력을 제공하고, 장기간의 시간주기에 걸쳐 정량화 될 수있다.
Abstract
난소 암은 복강 액에 흘리고 복막 내 원심 사이트에 분산 전이. 암 세포가 본질적으로 부착 및 이차 종양을 형성하는 복막 안감 침입하여 전이성 프로세스 올릴 다세포 구조로 응집으로서 단층 배양 정확하게, 비 접착 환경 내 암세포의 동작을 모델링하지 않는다. 난소 암 전이, 다세포 집계 또는 구 상체의 중요한 단계를 모델링하기 위해, 비 접착 조건 하에서 유지 확립 난소 암 세포주에서 생성 될 수있다. 생체 내에서 종양 세포에 의해 발생하는 복막 미세 환경을 모방하기 위해, 회전 타원체 – 중피 공동 문화 모델은 상체가 세포 외 기질 장벽 형성, 인간 중피 세포 단일 층 위에 도금하는 예비 성형하는 년에 설립되었습니다. 방법은 그 후에 정량적 실시간을 수행하는 실시간 셀 분석기를 사용하여 개발되었다상체로 성장 다른 난소 암 세포주의 침윤 능력의 시간 측정. 이 방식은 기존의 엔드 포인트 분석 등 힘든 실시간 현미경 이미지 분석을 통해 몇 가지 장점을 가지고 시간의 긴 기간 동안 침략의 연속 측정 할 수 있습니다. 요컨대,이 방법은 시간이 지남에 중피 매트릭스 장벽을 통해 침입하는 난소 암 타원체 세포 사이의 상호 작용을 조절 요인 신속한 결정을 가능하게한다.
Introduction
난소 암은 모든 부인과 암 1의 가장 높은 사망률을 가지고 있습니다. 전 세계적으로 ~ 230,000가지 경우 인해 매년 1 병에 100,000의 죽음이 있습니다. 대부분의 환자 (> 75 %)의 암이 이미 전이 된 후 치료가 더 화학 요법에 저항 증가에 의해 복잡하게되는 경우, 진단과 환자의 예후 (豫后)는 2 좋지 않습니다. 단계 III-IV 전이성 질환 환자는 30~40% 3 5 년 생존율이 있습니다. 따라서, 효과적으로 향상된 질병을 치료하기 위해 난소 암 전이의 기초가 셀룰러 동작의 더 나은 이해를위한 긴급한 필요가있다.
난소 암 전이의 현재 모델은 어떤 종양 행동에 영향 미세 환경에서 발생하는 별개의 각각의 전이 과정의 여러 단계를 제안한다. 을 전이 난소 암 세포는 처음에 기본 종양 사이트에서 창고 및 nonadher에서 살아남을 수 있습니다단일 셀 또는 3 차원 다세포 구조로 복강 액 내에서 ENT 상태, 다세포 집계 또는 상체 2,4,5라고. 서스펜션의 상체를 형성하지 않는 세포는 anoikis 2,4,5에 더 취약합니다. 구 상체는 또한 잔여 질병 및 암 2,4,5의 후속 반복에 기여하고, 화학 요법에 대한 내성을 증가 나타낸다. 난소 암 전이의 두 번째 중요한 단계는 복막 벽과 대망 5,6 내에 설립 이차 종양 자유 부동 클러스터에서 집계의 전환이다. 세포 – 세포 및 세포 – 기질 상호 작용은 집계 형성, 생존, 그리고 복막 4-11의 중피 라이닝에 의해 생성 된 세포 외 기질 (ECM) 준수에 연루되어있다. 아직 이러한 프로세스는 제대로 이해하고 있습니다.
난소 암의 보급에 관여하는 메커니즘을 정의하려면, 상체는 gener이 될 수 있습니다ated 배양액 12,13에 메틸 셀룰로오스를 첨가하여 또는 저 부착 2,14 플레이트에 세포를 배양하여 세포 현탁액 중의 어느 하나를 유지하는 비 접착 배양 방법을 사용하여 확립 된 암 세포주에서. 이 방법으로 배양 한 경우, 난소 암 세포는 생체 내에서 발견 2,14 종양 골재 마찬가지 세포 분자 및 생화학 적 특성을 나타낸다 다세포 응집체 또는 구 상체에 조립한다. 형성 후, 구 상체는 이후 비 접착 매체로부터 수확 될 수 있고, 추가적인 기능 연구에 대한 고체의 표면 상에 다양한 replated. 이것은 정확하게 같은 복막 유체로서 비 접착 환경 내을 전이 난소 암 세포의 행동을 모델화하지 않는 단층 배양에서 분석을 통해 사전을 나타낸다.
암 상체의 침습 용량 보이든 챔버이 전통적인 종점 분석법으로 평가할 수있다 </su난소 암 세포의 침공이 시간이 지남에 따라 역동적 인 과정이기 때문에 P>하지만,이 방법은, 오해의 소지가있을 수 있습니다. 최근 실시간 방법은 난소 암 상체에게 (15, 16)에 침입하여 중피 세포 정리의 시간 경과 비디오 현미경을 사용하여 고안되었습니다; 그러나, 시간 경과 데이터의 분석은 시간이 소요됩니다 주관적 일 수있다. 여기서, 실시간 난소 암 상체의 침습 행동을 평가하기위한 신속하고 정량적 방법이 설명된다. 첫째, 구형 – 중피 세포 모델은 다세포 상체가 연결하고 보조 종양을 형성하는 복막 안감을 공격 할 때 난소 암 전이의 단계를 나타내는 설립되었습니다. 그런 다음 실시간 세포 분석기 (RTCA, 회사 정보에 대한 자료 표 참조)에 대한 방법론은 상체로 성장이 모델에서 테스트 다른 난소 암 세포주의 침략 능력의 정량적 실시간 측정을 실시하도록했다.
RTCA에있는strument, 세포 반응은 전기 임피던스의 변화를 측정함으로써, 외인성 레이블에 대한 필요없이, 분석의 과정 동안 연속적으로 모니터링된다. 특별히 디자인 문화 판은 2 잘 챔버 ( 'CIM'판)의 상부 및 하부 챔버 사이의 계면에 미세 다공성 막 아래에있는 금 코팅 된 미세 전극이있다. 세포가 ECM 또는 ECM / 세포 장벽을 통해 침입으로 하부 챔버 내의 전극의 위치는 전기 임피던스의 변화를 측정 할 수있다. 각 CIM 판 우물의 2 챔버 사이의 막 인터페이스는 먼저 관심 ECM 성분으로 코팅되어 있습니다. 구형 – 중피 세포 모델 시스템에서 인터페이스는 인간 중피의 합류 단층 다음 복막의 중피 라이닝의 기초가되는 복잡한 ECM을 모방하는 리겔 층 (회사 자세한 내용은 재료 표 참조) '으로 코팅 대상 '세포. 마지막으로, 미리 형성된 난소 암 상체는 광고입니다DED. 난소 암 세포 타원체 적극적 하부 측실 도달 전기 임피던스 측정 값을 변경하는 표적 세포 층과 매트릭스를 통해 침입한다. 자신에 대한 표적 세포는 또한 그들이 매트릭스 층을 통해 침입 및이 분석에서 사용하기에 적합하지 않는 것을 보장하기 위해 평가된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
침입 난소 암 세포는 섬유 아세포, 지방 세포, 및 중피 세포 포함한 복막의 표면에 다양한 종류의 세포와 상호 작용하고, 암세포 및 복막 세포 사이의 양방향 통신이 전이 과정이 구동에 중요한 역할을하는 것으로 생각된다. 일단 마스터, 본원에 기재된 프로토콜은 복막 미세 환경 내에서 이러한 상호 작용의 연구에 용이하게 적응할 수있다, 예를 들어, 외인성 사이토 카인, 성장 인자, 또는 CIM 웰 플레이트 또는 유전자 조작의 상부 또는 하부 챔버에 특정한 억제제의 추가를 통해 복막 암 세포주. 또한,이 방법은 규제 신호 및 복강 내 전이 병변의 설립을 제어하는 세포의 상호 작용에 직접적인 통찰력을 얻기 위해 악성 복수 및 / 또는 기본 복막 세포에서 갓 수확 된 차 난소 종양 세포와 함께 사용할 수 있습니다 <s업> 2.
단일 세포 또는 상체의 침략 용량을 측정 할 수 RTCA 악기의 사용은 기존의 단일 엔드 포인트 분석과 시간 경과 이미지 분석을 통해 몇 가지 장점을 제공합니다. RTCA 계기는 몇 시간 또는 며칠이 될 수있는 분석의 과정을 통해 지속적으로 정의 된 간격으로 세포 침입을 측정합니다. 이것은 하나의 엔드 포인트 분석의 한계를 극복 시간에 침략의 속도, 변화의 결정을 할 수 있습니다. 예를 들어, 하나의 엔드 포인트 (그림 2), 예를 들면, 3 시간에 다른 암 세포 라인의 침입 데이터를 검사, KGN과 OVCA433 세포가 훨씬 더 침략 OVCA429 세포보다이었다 잘못된 결론에 LED가 있습니다. 이 기술의 또 다른 장점은 RTCA 악기 전기 임피던스의 변화를 측정한다는 것이다. 이 분석은 세포 페닐에 의도하지 않은 영향을 미칠 수있는 외생 에이전트와 세포를 라벨없이 실행할 수 있다는 것을 의미합니다otype 또는 함수입니다. 그들의 생체 활동이 반영되지 않는 분자 및 표현형 변화를 도입 피하기 위하여 최소한의 조작을 계속하는 것이 필수적이다있는 악성 복수, 유래 차 난소 암 세포를 연구 할 때 특히 중요하게된다. 또한, RTCA 악기의 사용은 시간 경과 현미경과 관련된 분석을 소모를 방지뿐만 아니라 분석의 최적화를위한 주요 실험 윈도우의 신속한 결정을 가능하게뿐만 아니라 실시간에 정량적 인 데이터의 수집을 가능하게합니다. 회전 타원체의 침공에 대한 다양한 요인의 영향을 비교할 때 이것은 특히 유용합니다, 같은 다른 요인은 다른 timepoints 또는 시간이 지남에 따라 크게 다른 프로필과 자신의 최대한의 효과를 발휘할 수있다.
이 프로토콜은 변경 (예컨대, 의무이지만 상이한 ECM 행렬, 다른 암 세포주 또는 상이한 타겟 CEL 사용이렇게하면 LS), 다양한 실험 조건은 우선 최적화되어야한다는 것을주의하는 것이 중요하다. 예를 들어, 이전에 회전 타원체의 내습 시험을 시작으로, 암 세포 / CIM 플레이트의 최적의 수는 물론 첫번째 단층 배양에서 세포 수의 적정 분석에 의해 결정되어야한다. 웰 당 사용하는 구 상체의 최적의 수는 다음이 분석에 기초한다. 처음으로 생성 될 때 예를 들어, 현재의 방법에서는, 구 상체는 각 약 3000 세포를 포함한다. 초기 세포 수의 적정은 단일 층에 30,000 세포 분석 침략의 검출을위한 최적의 것을 나타냅니다 경우, 10 상체가 잘 CIM 플레이트 당 추가됩니다. 공동 배양 실험을 수행 할 때 또한, 별도 이들 세포는이 결과를 혼동 할 수 있으므로, 본질적으로 침습 여부를 판정하기 위해 '타겟'세포 단층의 행동을 연구하는 것이 중요하다. 설명 된 예에서, 암은 상체 LP9 셀 monola 위에 도금된다FBS와와없는 YER은 화학 유인 물질뿐만 아니라 아래에 추가. 병행 LP9 세포는 각각의 처리 조건에서, 단독으로 배양된다.
세포 및 상체의 침습 용량을 연구 할 때 마찬가지로, 그것은이 동작을 (이주되지 않는 동안, 즉 침입 ECM 장벽의 단백질 분해 소화를 요구)를 구별하기 위해서뿐만 아니라 자신의 이동성 용량을 조사하는 것이 중요하다. 이를 위해, ECM 장벽을 생략 (3.1.1 단계 – 3.1.3) 그 자리에 ECM 장벽과 병렬로 분석을 실시하고 있습니다. 원하는 경우 후자의 '침략'법안은, 전 '마이그레이션'측정을 보정 할 수있다. 세포가 바닥 챔버 내로 침입 한 후에 자신의 어태치먼트, 확산, 및 멤브레인의 밑면에 증식의 변동의 변화에 기여할 수있다 : 마지막으로, 전기 임피던스의 측정으로부터 얻은 정보가 범위에 한정된다는 점에 유의하는 것이 중요 임피던스 정말이에요종소리. 종합적으로 구형 세포의 행동을 평가하기 위해 구형 세포 생존, 접착, 이동 및 형태의 다른 분석과 함께 사용하면 따라서,이 방법은 대부분의 정보를합니다. 회전 타원체 형태 및 건강의 질적 평가는 침입 정량적 RTCA 분석법과 평행 할 수 있도록 예를 들어, 이상적으로는, 완전 구형-중피 상호 작용을 이해하기 위해, 분리 된 공동 배양은 또한 표준 위상 현미경 하에서 주기적으로 묘화한다. 선택적 라벨링 공정이 수행되는 경우에 그들이 타원체로부터 해리하는 및 비 표지 중피 세포와 상호 작용할 때, 다음 번의 암세포의 행동은 형광 현미경 하에서 결정될 수있다. 제 2 셀 타입과 함께 공동 배양 될 때 형광 암세포 라벨의 추가 장점은 오직 암 세포가 세포와 ECM 장벽을 통해 침입 한 것을 확인하는 것이 가능하다는 것이다.
<p class="jove_content"> 요약하면,이 방법은 중피 및 ECM 장벽의 난소 암의 회전 타원체의 침공의 높은 처리량 정량 분석을 나타냅니다. 외인성 사이토 카인, 성장 인자, 또는 잘 CIM 판의 상부 또는 하부 챔버에 특정한 억제제의 추가를 통해,이 방법은 위에 중피 및 매트릭스 장벽을 통해 침입하는 난소 암 타원체 세포 사이의 상호 작용을 조절 인자의 신속한 결정을 가능하게 시간.Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 CASS 기초 과학 및 의학 부여에 의해 지원되었다; (MB); 호주 프로젝트 그랜트의 국립 보건 의학 연구위원회 (KLS, 338,516); 그리고 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램 (호주)에 의해.
Materials
| xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
| xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
| Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
| Methylcellulose (4000 centipose) | Sigma | M0512 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
| Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
| 96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
| LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
| Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |
Referencias
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