卵巢癌细胞侵入的腹膜间皮衬里是一个动态过程,随着时间的推移。利用实时分析器,卵巢癌细胞中的球状体,间皮细胞共培养模型的侵袭能力可以量化在延长的时间段,提供见解因子调控的转移过程。
卵巢癌转移由脱落到腹腔液和分散到腹膜内远端站点。单层培养物没有准确地模拟癌细胞的行为中的非粘附性的环境中,如肿瘤细胞本身聚集成由所附和侵入腹膜衬里以形成继发性肿瘤向转移过程的多细胞结构。建模的卵巢癌转移,多细胞聚集体,或球状体这一重要的阶段,可以从非粘性的条件下保持既定卵巢癌细胞系来产生。以模仿由肿瘤细胞在体内遇到的腹膜微环境,一个球体,间皮共培养模型建立在其中预先形成的球状体被镀上一个人腹膜间皮细胞单层的顶端,形成有外基质屏障。方法然后使用实时细胞分析仪进行定量实时研制成长为球状体不同卵巢癌细胞系的侵袭能力的时间测量。这种方法允许入侵过的时间,这比传统的端点检测和比较费力实时显微图像分析几个优点长时间的连续测量。总之,这种方法能够快速,测定其调节卵巢癌的细胞球体通过一段时间的间皮和基质屏障入侵之间的互动因素。
卵巢癌具有最高的病死率所有妇科癌症1。在世界范围内,有〜230000箱子和超过10万人死亡,每年1由于疾病。大多数患者(> 75%)被诊断后的癌症已经转移时,治疗是进一步提高对化疗的抵抗复杂和预后较差2。患者的Ⅲ〜Ⅳ期转移性疾病有只有30-40%,3年生存率。因此,目前迫切需要更好地了解细胞行为相关的卵巢癌转移,才能有效地治疗晚期疾病。
卵巢癌转移的当前模型提出在转移过程,其中每一个出现在一个独特的微环境对肿瘤行为影响的几个步骤。转移性卵巢癌的细胞最初是从原发肿瘤部位流下并在nonadher生存腹腔液为单细胞或三维的多细胞结构内的耳鼻喉科状态,称为多细胞聚集体或球状体2,4,5。不形成悬浮球体细胞更容易受到失巢凋亡2,4,5。球状体也表现出增加抗化疗药物,有助于残留病灶和随后的复发癌2,4,5。在卵巢癌转移的第二个关键步骤是聚集来自自由浮动集群腹腔壁及大网膜5,6内建立继发肿瘤的过渡。细胞-细胞和细胞-基质相互作用有牵连的聚集形成,生存,并坚持外基质(ECM)通过的4-11腹膜间皮面料制作。迄今,这些过程知之甚少。
确定涉及卵巢癌的传播机制,球体可以被根儿ated从使用非贴壁培养的方法,保持细胞悬浮液通过添加甲基纤维素的培养基12,13或由在低附着板2,14培养细胞建立细胞株。当以这种方式培养,卵巢癌细胞组装成多细胞聚集体或球状体而表现出类似的细胞,分子和生化特性的那些肿瘤的聚集的体内 2,14找到。形成后,球体可随后从非粘附介质收获和再接种到各种固体表面进行进一步的功能研究。这代表一个比预先测定单层培养,其不准确建模的卵巢癌细胞中的非粘附的环境,如腹腔内转移流体的行为。
肿瘤球体的侵袭能力可以在传统的端点检测在Boyden小室2进行评估</suP>,但这种方法可能会引起误解,因为卵巢癌细胞入侵是一个动态的过程随着时间的推移。最近的实时方法已经被使用皮细胞间隙的时间推移视频显微镜,入侵卵巢癌的球体15,16设计;然而,时间间隔分析数据是耗时的,并且可以是主观的。本文中,用于评估在实时的卵巢癌的球状体的侵入行为一个快速,定量方法进行说明。首先,建立一个球体,间皮细胞模型表示的卵巢癌转移的阶段时的多细胞球状体附着并侵入腹膜衬里以形成继发性肿瘤。随后,方法为实时细胞分析仪(RTCA,见材料表公司资讯)被改编进行成长为球体,并在此模型中测试了不同的卵巢癌细胞侵袭能力的实时定量测量。
在RTCA中沪西仪器,细胞的反应是连续监测了一个测定的过程中,而不需要外源的标签,通过测量变化的电阻抗。专门设计的培养板有位于微孔膜的下面以一个2腔以及('CIM“板)的上部和下部腔室之间的界面涂金微电极。电极在下部腔室中的位置的变化使电阻抗的测量作为细胞通过一个ECM或ECM /蜂窝屏障侵入。 2室每个CIM板孔之间的界面膜首先被涂覆有感兴趣的细胞外基质成分。在椭球间皮细胞模型系统,该接口被涂上一层基质胶(见材料表公司信息),以模仿复杂的ECM的腹膜间皮衬底层,其次是人皮的汇合单层'目标的细胞。最后,预成型的卵巢癌的球体是广告DED。卵巢癌的球体细胞必须积极通过侵入靶细胞层和基质到达底部腔和改变电阻抗读数。是对自己的靶细胞也评估,以确保它们不通过矩阵层侵入,并适合使用在该测定。
入侵的卵巢癌细胞与多种细胞类型的腹膜的表面相互作用,包括成纤维细胞,脂肪细胞和间皮细胞和癌细胞和腹膜细胞之间的双向通信被认为是在驱动转移过程2中发挥关键作用。一旦掌握,本文描述的协议是很容易地适应这些相互作用的腹膜微环境中的研究, 例如 ,通过添加外源性细胞因子,生长因子,或特异性抑制剂到CIM板孔或遗传操作的上部或下部腔室的的癌症或腹膜细胞系。此外,这种方法可与新鲜收获的来自恶性腹水和/或原发性腹膜细胞来获得直接见解的调节信号和哪些支配腹腔内建立一个转移灶的细胞相互作用原发性卵巢肿瘤细胞中可以使用<s了> 2。
使用RTCA仪器来测量单个细胞或球粒的侵入能力提供了比传统的单个端点检测和隔时图像分析的几个优点。在RTCA仪器测量细胞侵袭在定义的时间间隔连续地测定法,它可以是几小时或几天的过程。这使得改变的决心入侵的速度随着时间的推移,它克服了单一的端点检测的局限性。例如,检查从在一个单一的端点( 图2), 例如 ,3小时的不同肿瘤细胞系的侵袭数据,有可能导致错误的结论KGN和OVCA433细胞远比OVCA429细胞更具侵入性的。该技术的另一个优点是,RTCA仪器测量的变化的电阻抗。这意味着,检测可以在不与外源试剂标记细胞,这可能对细胞啉意想不到的效果运行otype或功能。此当 学习从恶性腹水,与它必须保持操作到最低限度,以避免引入的分子和表型的改变,是不反光的他们的体内性质2衍生的原发性卵巢癌细胞变得尤为重要。此外,使用RTCA仪器能够定量数据的收集实时,这不仅避免了耗时随时间推移显微镜相关分析也可以快速确定关键的实验窗口分析优化。比较各种因素对球体侵袭的影响时,这是特别有用的,因为不同的因素可能会发挥其最大效果在不同的时间点,或随时间大大不同的访问。
虽然这个协议是经得起改变( 例如 ,使用不同的细胞外基质基质,不同的肿瘤细胞株,或不同目标的CELls)的,如果这样做,必须注意的是不同实验条件下,必须首先进行优化是非常重要的。例如,前起球体入侵研究中,癌细胞/ CIM板的最佳数目以及应首先由细胞数目滴定在单层培养物测定法测定。球状体,每孔使用的最佳数量,然后在此基础上分析。例如,在当前的方法中,球体包括约3,000个细胞每一次时产生。如果初始细胞数滴定表明,30,000细胞单层是最优的检测入侵分析,然后10球粒每CIM板孔加入。此外,进行共培养实验时,它研究的“目标”细胞单层的行为分开,以确定这些细胞是否是天生侵入性,因为这可能会混淆的结果是很重要的。在展示的实例中,癌症球体被镀上一个LP9细胞monola的顶揭掉,有和没有FBS加入到底部以及化学引诱物。并联,LP9细胞单独培养,每个处理条件下进行。
同样,当学习细胞和球状体的侵入能力,但同样重要的是检查它们的迁徙能力以及为了区分这两种行为( 即侵入需要一个ECM屏障的蛋白水解消化而迁移不)。要做到这一点,省略ECM屏障(步骤3.1.1 – 3.1.3),并进行分析与到位的ECM屏障平行。后者的“入侵”的措施可以得到纠正,以昔日的“迁移”的措施,如果需要的话。一旦细胞已侵入底腔,改变其附着,铺展,并且在膜的下侧的增殖可以有助于改变:最后,需要注意的是从电阻抗的测量中获得的信息在范围上受到限制是非常重要的阻抗REA钟声。因此,在与球体细胞活力,粘附,迁移和形态等分析相结合,以全面评估球体细胞行为时使用这种方法是最翔实。例如,理想情况下,为了充分理解球体 – 间皮的相互作用,分离的共培养也应周期性地根据标准相显微镜成像,使得球体的形态和卫生质量评估可以与入侵定量RTCA测定平行进行。如果执行可选的标记步骤,然后单个癌细胞的行为,可以在荧光显微镜来确定,因为他们从球体分解,并与未标记的间皮细胞相互作用。的荧光标记的肿瘤细胞时共培养与第二细胞类型的附加的好处是,它是那么可以确认,只在癌细胞已经通过细胞与细胞外基质屏障侵入。
<p class="jove_content">总之,本方法代表卵巢癌球体入侵的间皮和细胞外基质屏障的高通量定量分析。通过添加外源性细胞因子,生长因子,或特异性抑制剂到CIM板的上部或下部腔室孔的,这种方法能够快速,测定其调节卵巢癌球体细胞通过间皮和基质屏障过度侵入之间的相互作用因子时间。The authors have nothing to disclose.
这项工作是由中国社会科学院基础科学和医学格兰特的支持; (MB);澳大利亚计划资助一个国家健康与医学研究理事会(KLS,338516);以及由维多利亚州政府的运作基础设施支持计划(澳大利亚)。
xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
Methylcellulose (4000 centipose) | Sigma | M0512 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |