Æggestokkene cancercelleinvasion i mesothelial foring af bughinden er en dynamisk proces over tid. Ved hjælp af en realtid analysator, kan den invasive kapacitet kræft i æggestokkene celler i en kugleformet-mesothelial celle co-kultur model kvantificeres over længere tidsperioder, der giver indsigt i faktorer, der regulerer metastatisk proces.
Ovariecancer metastaserer ved at udgyde i peritonealvæske og sprede til distale steder i bughinden. Monolagskulturer ikke nøjagtigt modellere adfærd af kræftceller i en nonadhærente miljø, som kræftceller sagens natur aggregere til flercellede strukturer, der bidrager til den metastatiske proces ved at knytte til og invaderer peritoneal foring til at danne sekundære tumorer. For at modellere denne vigtige fase af kræft i æggestokkene metastase, flercellede aggregater eller spheroids, kan genereres fra etablerede ovariekræft cellelinjer holdt under adhærerende forhold. At efterligne den peritoneale mikromiljø stødt af tumorceller in vivo blev en sfæroid-mesothelial co-kultur model, der som præformede sfæroider udplades på toppen af en human mesothelial cellemonolag, der er dannet i løbet af en ekstracellulær matrix barriere. Metoder blev derefter udviklet ved hjælp af en real-time celle analysator til at gennemføre kvantitativ realtidsmålinger af invasive kapacitet forskellige ovariecancer cellelinier som spheroids. Denne fremgangsmåde giver mulighed for kontinuerlig måling af invasion over lange perioder, som har flere fordele frem for traditionelle endpoint assays og mere omstændelig realtid mikroskopi billede analyser. Kort sagt, denne metode giver mulighed for en hurtig, bestemmelse af faktorer, der regulerer samspillet mellem kræft i æggestokkene kugleformede celler invaderer gennem mesothelial og matrix barrierer over tid.
Kræft i æggestokkene har den højeste dødelighed af alle gynækologiske kræftformer 1. På verdensplan er der ~ 230.000 tilfælde og over 100.000 dødsfald som følge af sygdommen hvert år 1. De fleste patienter (> 75%) er diagnosticeret efter kræften allerede har spredt sig, når behandlingen kompliceres yderligere af øget resistens over for kemoterapi og prognosen er dårlig 2.. Patienter med stadium III-IV metastatisk sygdom har fem år overlevelsesraten for kun 30-40% 3. Således er der et presserende behov for en bedre forståelse af de cellulære adfærd underliggende kræft i æggestokkene metastaser for effektivt at behandle fremskreden sygdom.
Den nuværende model af kræft i æggestokkene metastaser foreslår flere trin i den metastatiske proces, som hver især forekommer i en særskilt mikromiljø som har indvirkning på tumor adfærd. Metastaserende kræft i æggestokkene celler indledningsvis er kastet fra den primære tumor og overleve i en nonadherent stat inden for peritonealvæske som enkelte celler eller tredimensionelle flercellede strukturer, kaldet flercellede aggregater eller sphæroider 2,4,5. Celler, der ikke udgør spheroids i suspension er mere modtagelige for anoikis 2,4,5. Spheroids også udviser øget resistens over for kemoterapi, der bidrager til residual sygdom og efterfølgende tilbagefald af kræft 2,4,5. Et andet afgørende skridt i kræft i æggestokkene metastaser er overgangen af aggregater fra fritflydende klynger til etablerede sekundære tumorer i bugvæggen og omentum 5,6. Celle-celle og celle-substrat interaktioner har været impliceret i samlet formation, overlevelse, og tilslutning til den ekstracellulære matrix (ECM) produceret af mesothelial foring af bughinden 4-11. Endnu er disse processer dårligt forstået.
For at definere de mekanismer, der er involveret i udbredelsen af kræft i æggestokkene, kan spheroids være genereltated fra etablerede cancer cellelinjer hjælp adhærente dyrkningsmetoder, vedligeholdelse celler i suspension ved at tilføje methylcellulose til dyrkningsmedier 12,13 eller ved dyrkning af celler på lav-fastgørelsesplader 2,14. Når dyrket på denne måde, ovariecancerceller samle ind multicellulære aggregater eller sfæroider, som udviser lignende cellulære, molekylære og biokemiske egenskaber til dem i tumor aggregater findes in vivo 2,14. Efter dannelse kan spheroids efterfølgende høstet fra nonadhærente medium og genudplades på en bred vifte af faste overflader for yderligere funktionelle studier. Dette er et fremskridt i løbet af analyser i monolagskultur, som ikke nøjagtigt modellere adfærd af kræft i æggestokkene celler metastaserende inden en nonadhærente miljø som intraperitoneal væske.
Den invasive kapacitet kræft spheroids kan vurderes i traditionelle endpoint assays i Boyden kamre 2 </sup>, men denne fremgangsmåde kan være misvisende, da æggestokkene kræftcelle invasion er en dynamisk proces over tid. En nylig realtid metode er blevet udviklet ved hjælp af time-lapse video mikroskopi af mesothelial celle clearance af invaderende ovariecancer spheroids 15,16; imidlertid analyse af tidsforskydningen data er tidskrævende og kan være subjektiv. Heri er en hurtig, kvantitativ metode til vurdering af de invasive adfærd af kræft i æggestokkene spheroids i realtid beskrevet. For det første blev en kugleformet-mesothelial celle model etableret som repræsenterer den fase af kræft i æggestokkene metastaser når flercellede sphæroider tillægger og invadere peritoneal foring til at danne sekundære tumorer. Så metode for et Real Time Cell Analyzer (RTCA, se Materialer tabellen firmaoplysninger) blev tilpasset til at foretage kvantitativ real time målinger af invasive kapacitet forskellige ovariecancer cellelinier som spheroids og testet i denne model.
I RTCA iinstrument er cellulære reaktioner overvåges kontinuerligt i løbet af et assay, uden behov for udefra kommende etiketter ved at måle ændringer i elektrisk impedans. Specielt designet dyrkningspladerne har guld belagt mikroelektroder placeret under en mikroporøs membran på grænsefladen mellem de øvre og nedre kamre af en 2 chambered godt (»CIM« plader). Placeringen af elektroderne i det nedre kammer muliggør målingen af ændringer i elektrisk impedans som celler invaderer gennem en ECM-eller ECM / cellulær barriere. Membranen grænsefladen mellem de 2 kamre i hver CIM plade brønd først belagt med ECM komponenten af interesse. I sfæroid-mesothelial celle modelsystem, er grænsefladen overtrukket med et lag Matrigel (se Materialer tabellen firmadetaljer) at efterligne komplekse ECM underliggende mesothelial foring af bughinden, efterfulgt af et konfluent monolag af humane mesothelial ' mål 'celler. Endelig Forbøjede ovariecancer spheroids er adDED. Kræft i æggestokkene kugleformede celler skal aktivt invadere gennem targetcellerne lag og matrix for at nå bunden kammer og ændre elektriske impedans aflæsninger. Målceller på deres eget vurderes også at sikre, at de ikke invadere gennem matrixen lag og er egnede til anvendelse i dette assay.
Invaderende ovariecancerceller interagere med en række celletyper på overfladen af bughinden, herunder fibroblaster, adipocytter, og mesotelceller og tovejskommunikation mellem cancerceller og peritoneale celler menes at spille en vigtig rolle i at drive metastatiske proces 2. Når mestrer, protokollen beskrevet heri let kan tilpasses til studiet af disse interaktioner i den peritoneale mikromiljø, fx ved tilsætning af exogene cytokiner, vækstfaktorer, eller specifikke inhibitorer til de øvre eller nedre kamre i CIM pladen godt eller genetisk manipulation af kræft eller peritoneale cellelinier. Endvidere kan denne metode bruges med primær ovarie tumorceller høstet frisk fra malign ascites og / eller primære peritonealceller at få direkte indsigt i de regulatoriske signaler og cellulære interaktioner, som regulerer etableringen af en metastatisk læsion i bughulen <sop> 2..
Anvendelse af RTCA instrument til at måle invasive kapacitet af enkelte celler eller spheroids giver flere fordele i forhold til konventionelle enkelt endpoint assays og time-lapse billede analyser. Den RTCA Instrumentet måler cellulær invasion ved definerede intervaller kontinuerligt i løbet af en analyse, som kan være timer eller dage. Dette muliggør bestemmelse af ændringer i antallet af invasionen over tid, hvilket overvinder de begrænsninger af en enkelt endpoint assays. For eksempel undersøger invasions data fra de forskellige cancer cellelinjer på en enkelt endpoint (figur 2), fx 3 timer, kunne have ført til den fejlagtige konklusion, at KGN og OVCA433 celler var langt mere indgribende end OVCA429 celler. En anden fordel ved denne teknologi er, at RTCA Instrumentet måler ændringer i elektrisk impedans. Det betyder, at analyser kan køres uden mærkning af celler med en eksogen middel, hvilket kan have utilsigtede virkninger på celle Phenotype eller funktion. Dette bliver særlig vigtigt, når man studerer primær ovariecancer celler fra malign ascites, hvormed det er bydende nødvendigt at holde manipulationer til et minimum for at undgå at indføre molekylære og fænotypiske ændringer, som ikke er reflekterende af deres in vivo natur 2. Endvidere er anvendelsen af RTCA instrument muliggør indsamling af kvantitative data i realtid, som ikke kun undgår tidskrævende analyser forbundet med time-lapse mikroskopi, men giver også mulighed for hurtig bestemmelse af centrale eksperimentelle vinduer til analyse optimering. Dette er især nyttigt, når man sammenligner effekten af en række faktorer på klumpformet invasion, kan lige så forskellige faktorer udøver deres maksimale virkninger på forskellige tidspunkter eller med meget forskellige profiler over tid.
Selv om denne protokol er modtagelig for ændringer (f.eks brug af forskellige ECM-matrix, forskellige cancer cellelinjer, eller forskellige mål cells), hvis dette er det vigtigt at bemærke, at forskellige eksperimentelle betingelser først skal optimeres. For eksempel før påbegyndelse af studier af klumpformet invasion, det optimale antal af kræftceller / CIM plade vel skal først bestemmes ved analyse af celle nummer titreringer i monolagskultur. Det optimale antal sphæroider at bruge per godt derefter baseret på denne analyse. For eksempel i den nuværende metode, sfæroider omfatter cirka 3.000 celler hver, når først genereres. Hvis oprindelige celleantal titreringer viser, at 30.000 celler i monolag er optimale for påvisning i invasion analyser, derefter tilsættes 10 sfæroider pr CIM plade godt. Endvidere, når ledende co-kultur eksperimenter, er det vigtigt at studere adfærd af den "target 'cellemonolag separat for at afgøre, hvorvidt disse celler er i sagens natur invasive, da dette kan forvirre resultaterne. I eksemplet påvises, er cancer sfæroider udpladet på toppen af en LP9 celle Monolayer med og uden FBS tilsat til bunden samt en kemoattraktant. Sideløbende er LP9 celler dyrket alene, under hver behandling betingelse.
Tilsvarende, når man studerer den invasive kapacitet af celler og sfæroider er det også vigtigt at undersøge deres vandrende kapacitet samt for at skelne mellem de to adfærd (dvs. invasion kræver proteolytisk spaltning af et ECM barriere mens migration ikke). For at gøre dette, udelade ECM barriere (trin 3.1.1 – 3.1.3) og gennemføre analysen parallelt med ECM barriere på plads. Sidstnævnte 'invasion' foranstaltning kan rettes til den tidligere "migration" foranstaltning, hvis det ønskes. Endelig er det vigtigt at bemærke, at oplysninger fra de foranstaltninger af elektriske impedans er begrænset i omfang: Når cellerne har invaderet i bunden kammer, kan ændringer i deres fastgørelse, spredning og spredning på undersiden af membranen bidrage til ændringer i impedans readings. Derfor er denne metode er mest informative, når de anvendes i forbindelse med andre assays af kugleformet cellelevedygtighed, adhæsion, migration og morfologi med henblik på grundig vurdering kugleformede celle adfærd. For eksempel ideelt, for fuldt ud at forstå kugleformede-mesotelial interaktioner, separate co-kulturer bør også afbildes periodisk under standard fasemikroskopi, så der kan foretages kvalitative vurderinger af sfæroid morfologi og sundhed parallelt med kvantitative RTCA assays af invasion. Hvis det valgfrie mærkning trin er udført, så den adfærd af enkelte kræftceller kan bestemmes under fluorescerende mikroskopi, da de løsrives fra klumpformet og interagere med de umærkede mesotelceller. En ekstra fordel ved fluorescerende mærkning af cancerceller ved co-dyrkning med en anden celletype er, at det så er muligt at bekræfte, at kun kræftcellerne har invaderet de barrierer celler og ECM.
<p class="jove_content"> Sammenfattende denne metode repræsenterer en high throughput kvantitativ analyse af æggestokkræft klumpformet invasion af mesothelial og ECM barrierer. Gennem tilsætning af exogene cytokiner, vækstfaktorer, eller specifikke inhibitorer til de øvre eller nedre kamre i CIM pladen godt, denne metode giver mulighed for en hurtig, bestemmelse af faktorer, der regulerer samspillet mellem kræft i æggestokkene kugleformede celler invaderer gennem mesothelial og matrix barrierer i tid.The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en CASS Foundation Natur-og Sundhedsvidenskabelige Grant; (MB); en National Health & Medical Research Council i Australien Project Grant (KLS, 338.516); og af den victorianske regering operationelle infrastruktur Support Program (Australien).
xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
Methylcellulose (4000 centipose) | Sigma | M0512 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |