Periton mezotel zarının içine yumurtalık kanseri hücre işgali zamanla dinamik bir süreçtir. Gerçek zamanlı analiz kullanarak, bir küremsi-mezotel hücresi eş-kültür modelinde, yumurtalık kanseri hücrelerinin invaziv kapasitesi metastatik işlemini düzenleyen faktörleri bakış açıları sağlayan, uzun süreler boyunca ölçülebilir.
Yumurtalık kanserleri periton sıvısı içine dökülme ve periton içinde uzak sitelere dağıtılmasıyla metastaz. Kanser hücreleri, doğal olarak takmak ve sekonder tümörler oluşturmak için peritoneal astar istila metastatik sürecine katkıda çok hücreli yapılar halinde toplamak gibi tek tabakalı kültürler doğru, yapışkan olmayan bir ortam içinde, kanser hücrelerinin davranışları modeli yoktur. Yumurtalık kanseri metastazı, çok hücreli agrega, ya da küresel cisimler bu önemli aşama modellemek için, yapışkan olmayan koşullar altında tutulur kurulmuş yumurtalık kanseri hücre hatları oluşturulabilir. In vivo olarak tümör hücreleri tarafından karşılaşılan periton mikro taklit etmek için, küremsi-mezotel ko-kültür modeli küreler, hücre dışı bir matris bariyer üzerinde oluşturulan bir insan mezotel hücre mono tabakasının üzerine plakalanır önceden edildiği kurulmuştur. Yöntem daha sonra kantitatif gerçek yapmak için gerçek zamanlı bir hücre analiz cihazı kullanılarak geliştirilmiştirküremsi olarak yetiştirilen farklı yumurtalık kanseri hücre çizgilerinin invaziv kapasitesinin zaman ölçümleri. Bu yaklaşım, geleneksel uç nokta tahlilleri ve daha zahmetli gerçek zamanlı mikroskobu resim analizleri üzerinde birçok avantajı vardır zaman, uzun süreler boyunca işgalinin sürekli ölçülmesi için izin verir. Kısaca, bu yöntem, zaman içinde mezotel ve matris bariyerleri istila yumurtalık kanseri küremsi hücreler arasındaki etkileşimleri düzenleyen faktörlerin bir hızlı ve tespitine olanak sağlar.
Yumurtalık kanseri tüm jinekolojik kanserlerin 1 en yüksek ölüm oranına sahiptir. Dünya çapında, ~ 230.000 olgu nedeniyle her yıl 1 hastalığa 100.000 ölüm vardır. Hastaların çoğu (>% 75) kanser zaten metastaz sonra tedavi daha kemoterapi artan direnci ile komplike olduğunda, tanı ve prognoz 2 kötüdür. Evre III-IV metastatik hastalığı olan hastalar sadece% 30-40 3 5 yıllık sağkalım oranları var. Bu nedenle, etkin bir şekilde ileri hastalığı tedavi etmek amacıyla, yumurtalık kanseri metastazı altında yatan hücresel davranışların daha iyi anlaşılması için acil bir ihtiyaç vardır.
Yumurtalık kanseri metastazı mevcut model, tümör davranışı üzerindeki etkileri farklı bir mikro oluşur, her biri metastaz, çeşitli adımlar önermektedir. Metastaz yumurtalık kanseri hücreleri, başlangıçta primer tümör sitesinden döken ve nonadher hayatta edilirtek hücre ya da üç boyutlu bir çok-hücreli yapılar da peritoneal sıvı içinde ent durum, agregatları ya da çok-hücreli küremsilerin 2,4,5 adlandırılır. Süspansiyon içinde küremsilerin oluşturmazlar hücreler anoikis 2,4,5 karşı daha hassastır. Ayrıca, küremsi kalıntı hastalığı ve kanser 2,4,5 daha sonra yeniden oluşumuna katkıda kemoterapi direnci artış görülmez. Yumurtalık kanseri metastazı ikinci bir kritik adım periton duvarı ve omentum 5,6 bünyesinde kurulan ikincil tümörlerde serbest-yüzen kümelerden agrega geçiştir. Hücre-hücre ve hücre-substrat etkileşimleri agrega oluşumu, hayatta kalma ve periton 4-11 mezotel astar tarafından üretilen hücre dışı matrisin (ECM) uyulması implike edilmiştir. Henüz olarak, bu süreçlerin tam olarak anlaşılamamıştır.
Yumurtalık kanserlerinin yayılmasında rol mekanizmaları tanımlamak için, küremsiler homo olabilirated kültür ortamı 12,13 için metilselüloz ekleyerek ya da düşük tespit kalıpları 2,14 üzerinde hücrelerin kültürlenmesi ile, ya süspansiyon içinde hücrelerin bakımı, yapışmayan kültürü yöntemleri kullanılarak kurulmuştur kanseri hücre hatları. Bu şekilde kültürlendi olduğunda, yumurtalık kanser hücrelerinin in vivo 2,14 bulunan tümör agrega benzer hücresel, moleküler ve biyokimyasal özellikleri gösteren çok-agregatlar ya da küresel cisimler içine monte edin. Oluşmasından sonra, sferoidler, daha sonra yapışmayan ortamından hasat edilebilir ve daha fazla fonksiyonel çalışmalar için katı çeşitli yüzeyler üzerine kaplandı. Bu doğru örneğin intraperitoneal sıvısı olarak bir yapışkan olmayan bir ortam içinde metastaz yumurtalık kanseri hücrelerinin davranışları modeli olmayan tek tabakalı kültürü deneyleri üzerinde bir ilerlemeyi temsil etmektedir.
Kanser küremsi girici kapasitesi Boyden odalarına 2, geleneksel nokta deneylerinde değerlendirilebilir </suyumurtalık kanseri hücre işgali zamanla dinamik bir süreç olarak p>, ancak bu yaklaşım, yanıltıcı olabilir. Yeni bir gerçek-zamanlı yöntem yumurtalık kanseri küremsilerden 15,16 işgal ederek mezotel hücre açıklık time-lapse video mikroskopi kullanılarak icat edilmiştir; Ancak, zaman atlamalı verilerin analizi zaman alıcı ve öznel olabilir. Burada, gerçek zamanlı olarak yumurtalık kanseri küremsiler istilacı davranışlarını değerlendirmek için hızlı bir nicel bir yöntem tarif edilmektedir. İlk olarak, bir küremsi-mezotel hücre modeli çok-hücreli küreler, takmak ve sekonder tümörler oluşturmak için peritoneal astar işgal zaman yumurtalık kanseri metastazı aşamasını temsil eden kurulmuştur. Daha sonra gerçek zamanlı hücre Analyzer (RTCA, şirket ayrıntılar için malzemeler tabloya bakınız) için yöntem sferoitlerin olarak büyüdü ve bu modelde test edilen farklı yumurtalık kanseri hücre çizgilerinin invaziv kapasitesinin nicel gerçek zaman ölçümlerini yapmak için uyarlanmıştır.
RTCA Instrument, hücresel tepkileri elektrik empedans değişiklikleri ölçerek eksojen etiketler için gerek kalmadan, bir tahlilin boyunca sürekli olarak izlenir. Özel olarak tasarlanmış kültür levhaları, 2 de odalı ('CIM' plakalar) üst ve alt odalar arasındaki arayüzde bir mikro-gözenekli zarın altında bulunan altın kaplama Mikroelektronlar sahiptir. Hücreler, bir ECM ya da ECM / hücresel bariyeri ile işgal olarak alt bölme içinde elektrotların yer elektrik empedans değişimlerin ölçümü sağlar. Her bir CIM levha kuyunun 2 odaları arasında Zar arayüz ilk çıkar ECM bileşeni ile kaplanır. Küremsi-mezotel hücre modeli sisteminde, arayüz insan mezoteliyalı bir konfluent tek tabaka ardından periton mezotel astar yatan karmaşık ECM taklit etmek Matrigel tabakası (şirket ayrıntılar için malzemeler tabloya bakınız), 'ile kaplanır Hedef 'hücreler. Son olarak, önceden şekillendirilmiş, yumurtalık kanseri olan bir reklam sferoidlerded. Yumurtalık kanseri küremsi hücrelerinin aktif alt bölmeyi ulaşmak ve elektrik empedansı okumaları değiştirmek için hedef hücreler katmanı ve matris işgal gerekir. Kendi Hedef hücreler aynı zamanda matris tabaka boyunca işgal ve bu tahlilde kullanım için uygun olan emin olmak için değerlendirilir.
Istila yumurtalık kanseri hücreleri, fibroblastlar, adipositler ve mezotel hücreleri de dahil olmak üzere, periton yüzeyindeki hücre tiplerinin çeşitli etkileşim ve kanser hücreleri ve peritoneal hücrelerinin arasında iki yönlü iletişim metastatik süreci 2 sürüş kilit rol oynadığı düşünülür. Bir kez hakim, burada tarif edilen protokol mikro-peritoneal olan bu etkileşimlerin çalışmaya kolayca adapte edilebilir, örneğin, eksojen sitokinler, büyüme faktörleri ya da CIM plaka ya da genetik manipülasyon üst veya alt hazneye özgü inhibitörlerin eklenmesi ile kanser ya da peritoneal hücre çizgilerinin. Ayrıca, bu yöntem, düzenleyici sinyaller ve periton boşluğu içinde bir metastatik lezyonun yöneten kuruluş hücresel etkileşimler direkt bilgiler edinmek için malign asit ve / veya birincil peritoneal hücrelerden taze hasat edilmiş primer yumurtalık tümör hücreleri ile birlikte kullanılabilir <skadar> 2.
Tek hücre ya da küresel cisimler invaziv kapasitesini ölçmek için RTCA aletin kullanımı, geleneksel tek bir uç nokta tahlilleri ve zaman atlamalı resim analizleri fazla birkaç avantaj sunar. Rtca enstrüman saat veya gün olabilir, bir deneyinde boyunca sürekli belirli aralıklarla hücresel işgali ölçer. Bu tek nokta deneylerinin kısıtlamaların üstesinden zamanla invazyon oranı, değişikliklerin tespitine olanak sağlar. Örneğin, bir tek son nokta (Şekil 2), örneğin, 3 saat sonra farklı kanser hücre hatları işgali verileri inceleyerek, KGN ve OVCA433 hücreler çok daha invaziv OVCA429 hücrelerden daha vardı hatalı sonuca neden olabilir. Bu teknolojinin bir diğer avantajı da RTCA alet elektrik empedans değişiklikleri ölçen olmasıdır. Bu işlemler hücre phen üzerinde istenmeyen etkileri olabilir ki, dışsal bir ajan ile hücrelerin etiketlenmesi olmadan çalıştırılabilir anlamına gelirotype veya fonksiyon. Bu in vivo doğaya 2 yansıtıcı olmayan moleküler ve fenotipik değişiklikler meydana getirilmesini önlemek amacıyla en az manipülasyon tutmak için zorunludur hangi habis asit, türetilen birincil yumurtalık kanser hücrelerinin okuyan bu özellikle önemli hale gelir. Ayrıca, Rtca alet kullanımı zaman zaman atlamalı mikroskopi ile ilgili analizler tüketen önler ama aynı zamanda tahlil optimizasyonu için anahtar deneysel pencere hızla belirlenmesini sağlar sadece gerçek zamanlı, nicel verilerin toplanmasını sağlar. Küremsi istilası üzerinde bir dizi faktöre etkilerini karşılaştırarak, bu özellikle yararlıdır, gibi çeşitli faktörler, farklı zaman noktalarında ya da zaman içinde büyük ölçüde farklı profillere sahip maksimal etkiler de sarf edebilirler.
Bu protokol değişiklikler (örneğin, için uygun olmasına rağmen, farklı bir ECM matris, değişik kanser hücresi çizgileri veya farklı hedef cel kullanımıBunu yaparken eğer ls), çeşitli deneysel koşullar ilk optimize edilmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Örneğin, önceki küremsi invazyon çalışmaları başlamadan, kanser hücre / CIM plakanın uygun sayısı de ilk olarak tek tabakalı kültürü hücre sayısı titrasyon deneyi ile tespit edilmelidir. Oyuk başına kullanımı küremsiler uygun sayısı bu analizlere dayanmaktadır. Ilk oluşturulan Örneğin, mevcut yöntemde, sferoidler, her biri yaklaşık 3000 hücreleri içermektedir. İlk hücre sayısı titrasyon tek tabaka içinde 30,000 hücre analizleri istilasında tespiti için en uygun olan olduğunu göstermektedir, daha sonra 10 sferoidler de CIM tabak başına eklenir. Ko-kültür deneylerini yaparken Dahası, ayrı ayrı bu hücrelerin sonuçları yıkmak olabilir gibi, doğal olarak invaziv olup olmadığını belirlemek için 'hedef' hücre tek tabaka davranışlarını incelemek için önemlidir. Gösterilen örnekte, kanser sferoidler bir LP9 hücre Monola üzerine plakalanırFBS ve olmayan Yer, kemo-çekici olarak da altına ilave edildi. Buna paralel olarak, LP9 hücreler her bir ıslah koşulları altında, tek başına kültürlenir.
Hücre ve küremsi istilacı kapasitesini incelemek Benzer şekilde, bu iki davranışları (geçiş yok iken, yani istila bir ECM bariyerin proteolitik sindirimi gerektirir) ayırmak için de kendi kapasitelerini göç incelemek için de önemlidir. Bunu yapmak için, ECM bariyer ihmal (3.1.1 adımlar – 3.1.3) ve yerine ECM bariyer paralel olarak, deneyi yürütmek. Istenirse ikincisi 'işgali' ölçüsü, eski 'göç' tedbire düzeltilebilir. Hücrelerin alt odaya işgal kez, bunların bağlanma, yayma ve zarın alt çoğalmasında bir değişiklik değişikliklere katkıda bulunabilir: Son olarak, bu elektrik empedans ölçümleri elde edilen bilgi kapsamı sınırlıdır dikkat etmek önemlidir empedans readings. Kapsamlı küremsi hücre davranışlarını değerlendirmek amacıyla küremsi hücre canlılığı, yapışması, göç ve morfolojisinin diğer deneyleri ile birlikte kullanıldığında, bu nedenle, bu yöntem en çok bilgilendirici. Küremsi morfolojisi ve sağlık niteliksel değerlendirmeleri istila kantitatif RTCA deneyleri paralel olarak yapılabilir, böylece örneğin, ideal olarak, tam olarak küremsi-mezotel etkileşimleri anlamak amacıyla, ayrı eş-kültür, aynı zamanda standart faz mikroskobu altında periyodik görüntülü olmalıdır. İsteğe bağlı etiketleme aşaması gerçekleştirilir, bunlar sfero gelen, parçalamak ve işaretlenmemiş mezotel hücreleri ile etkileşime, daha sonra bir kanser hücrelerinin davranışları floresan mikroskobu altında belirlenebilir. Ikinci bir hücre tipi ile birlikte kültür sırasında flüoresan kanser hücrelerinin etiketlenmesi bir yararı, sadece kanser hücreleri, hücre ve ECM engelleri işgal onaylamak için zaman mümkün olmasıdır.
<p class="jove_content"> Özet olarak, bu yöntem ve mezotel ECM engellerin yumurtalık kanseri küremsi işgalinin bir yüksek verimli nicel analizini temsil etmektedir. Ekzojen sitokinler, büyüme faktörleri, ya da iyi CIM plakanın üst ya da alt bölmelerine özel inhibitörlerinin eklenmesi yoluyla, bu yöntem üzerinde mezoteliyalı ve matris bariyerleri istila yumurtalık kanseri küremsi hücreler arasındaki etkileşimleri düzenleyen faktörler, hızlı, belirlenmesini sağlar zamanı.The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma CASS Vakfı Bilim ve Tıp Grant tarafından desteklenmiştir; (MB); Avustralya Projesi Hibe Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (KLS, 338516); ve Victoria Hükümeti'nin Operasyonel Altyapı Destek Programı (Avustralya) tarafından.
xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
Methylcellulose (4000 centipose) | Sigma | M0512 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |