Eierstockkrebszellinvasion in die Mesothelzellen Auskleidung des Bauchfells ist ein dynamischer Prozess über die Zeit. Mit Hilfe eines Echtzeit-Analysator, kann die invasive Kapazität von Eierstockkrebszellen in einem Sphäroid-Mesothelzelle Co-Kultur-Modell über längere Zeiträume quantifiziert werden, Einblicke in Faktoren Regelung der metastatischen Prozesses.
Eierstockkrebs Metastasen durch den Abbau in die Bauchfellflüssigkeit und Dispergieren distalen Stellen innerhalb des Bauchfells. Monolayer-Kulturen nicht genau das Verhalten von Krebszellen zu modellieren innerhalb einer nichthaftende Umwelt, wie Krebszellen in sich zusammenfassen in multizellulären Strukturen, die auf den metastatischen Prozess, indem es an und Eindringen in die Bauchfellfutter zur sekundären Tumoren bilden beitragen. Um diese wichtige Phase von Eierstockkrebs Metastasen, vielzelligen Aggregaten, Sphäroiden oder modellieren, können von etablierten Eierstockkrebszelllinien unter Bedingungen gehalten, nicht anhaftende erzeugt werden. In die Bauchmikroumgebung von Tumorzellen in vivo angetroffen nachzuahmen, wurde ein Sphäroid-Mesothelzellen Co-Kulturmodell etabliert, in dem vorgeformten Kügelchen werden auf einem menschlichen Mesothelzellen Zellmonoschicht überzogen, auf einer extrazellulären Matrix Barriere gebildet. Methoden wurden dann mit Hilfe eines Echtzeit-Zellanalysegerät, um quantitative real durchzuführen entwickeltZeitmessungen der invasiven Kapazität von verschiedenen Eierstockkrebszelllinien als Sphäroiden gewachsen. Dieser Ansatz ermöglicht die kontinuierliche Messung der Invasion über lange Zeiträume, die mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Endpunkt-Assays und mühsamer Bild Echtzeit-Mikroskopie analysiert hat. Kurz gesagt, ermöglicht diese Methode eine schnelle Bestimmung von Faktoren, die die Wechselwirkungen zwischen Eierstockkrebs-Zellen eindringende Sphäroid durch Mesothelzellen und Matrix-Barrieren im Laufe der Zeit zu regulieren.
Eierstockkrebs hat die höchste Sterblichkeitsrate aller gynäkologischen Krebserkrankungen ein. Weltweit gibt es ~ 230.000 Fälle und mehr als 100.000 Todesfälle durch die Krankheit jedes Jahr ein. Die meisten Patienten (> 75%) werden diagnostiziert, nachdem der Krebs bereits Metastasen gebildet hat, wenn die Behandlung durch erhöhte Resistenz gegen Chemotherapie kompliziert und die Prognose ist schlecht 2. Patienten mit Stadium III-IV Metastasen haben 5 Jahres-Überlebensraten von nur 30-40% 3. Somit besteht ein dringender Bedarf für ein besseres Verständnis der zellulären Verhaltensweisen, um effektiv zu behandeln fortgeschrittener Erkrankung zugrunde liegenden Eierstockkrebsmetastasen.
Das aktuelle Modell von Eierstock-Krebs Metastasen schlägt mehrere Schritte in der metastatischen Prozess, von denen jeder tritt in einer ausgeprägten Mikro welche Auswirkungen auf Tumorverhalten. Metastasierenden Eierstockkrebszellen zunächst aus dem Primärtumors zu vergießen und zu überleben in einer nonadherent Zustand innerhalb der Peritonealflüssigkeit als einzelne Zellen oder dreidimensionale Strukturen vielzelligen, genannt vielzelligen Aggregaten oder Sphäroiden 2,4,5. Zellen, die in Suspension nicht Sphäroide bilden, sind anfälliger für anoikis 2,4,5. Sphäroide auch eine erhöhte Resistenz gegen Chemotherapeutika, Beitrag zur Resterkrankung und nachfolgende Wiederauftreten des Krebses 2,4,5. Ein zweiter kritischer Schritt bei Eierstockkrebsmetastasen ist der Übergang von Zuschlagstoffen aus frei schwebenden Cluster etabliert Sekundärtumoren in der Bauchwand und Netz 5,6. Zell-Zell-und Zell-Substrat-Wechselwirkungen in Aggregatbildung, das Überleben und die Einhaltung der extrazellulären Matrix (ECM) von der Mesothelzellen Auskleidung des Bauchfells 4-11 hergestellten Verbindung gebracht. Bisher werden diese Prozesse kaum verstanden.
Um die Mechanismen bei der Verbreitung von Eierstockkrebs beteiligt zu definieren, können Sphäroiden Gener seinte an etablierten Tumorzelllinien unter Verwendung von nicht-adhärenten Kulturmethoden, die Aufrechterhaltung Zellen in Suspension entweder durch Zugabe von Methylcellulose zu den Kulturmedien 12,13 oder durch Kultivieren von Zellen auf Low-Befestigungsplatten 2,14. Wenn auf diese Weise kultiviert, montieren Eierstockkrebszellen in multizellulären Aggregaten oder Kügelchen, die ähnlich zellulären, molekularen und biochemischen Eigenschaften denen von Tumor Aggregate in vivo 2,14 gefunden aufweisen. Nach der Bildung kann Sphäroide anschließend von dem nicht anhaftenden Medium geerntet und auf eine Vielzahl von festen Oberflächen für die weitere funktionelle Studien wieder ausplattiert werden. Dies stellt einen Fortschritt gegenüber Assays in Monolayer-Kultur, die nicht genau zu modellieren sie das Verhalten der metastasierenden Eierstockkrebszellen in einem nicht-adhärenten Umgebung wie die intraperitoneale Flüssigkeit.
Die invasive Kapazität von Krebs Sphäroiden in traditionellen Endpunkt-Assays in Boyden-Kammern 2 bewertet </sup>, aber dieser Ansatz kann irreführend sein, da Eierstockkrebszellinvasion ist ein dynamischer Prozess über die Zeit. Eine aktuelle Echtzeit-Verfahren wurde mit Zeitraffer-Videomikroskopie von Mesothelzelle Freigabe durch eindringende Eierstockkrebs entwickelt Sphäroiden 15,16; jedoch ist die Analyse von Zeitreihen-Daten zeitaufwendig und kann subjektiv sein. Hierbei wird eine schnelle, quantitative Methode zur Bestimmung der invasiven Verhalten von Eierstockkrebs Sphäroide in Echtzeit beschrieben. Zunächst wurde ein Sphäroid-Mesothelzelle Modell eingesetzt, der die Bühne von Eierstockkrebsmetastasen stellt, wenn mehrzelligen Sphäroiden befestigen und dringen in die Bauchfellfutter zur sekundären Tumoren bilden. Dann Methodik für eine Echtzeit Zell Analyzer (RTCA, siehe Tabelle Materialien für Firmendaten) wurde angepasst, um quantitative Echtzeit-Messungen der Invasionskapazität von verschiedenen Eierstockkrebszelllinien als Sphäroiden gewachsen und in diesem Modell getestet befragen.
In der RTCA inInstrument, zelluläre Reaktionen werden kontinuierlich über den Verlauf eines Assays durch Messung von Veränderungen der elektrischen Impedanz überwacht wird, ohne die Notwendigkeit einer exogenen Etiketten. Speziell entwickelten Kulturplatten mit Gold beschichteten Mikroelektroden unter einer mikroporösen Membran an der Grenzfläche zwischen den oberen und unteren Kammern eines Kammer 2 gut ("CIM"-Platten) liegt. Die Lage der Elektroden in der unteren Kammer ermöglicht die Messung von Veränderungen in der elektrischen Impedanz als Zellen eindringen oder durch eine ECM ECM / Zellbarriere. Die Membran-Grenzfläche zwischen den 2 Kammern jedes CIM Platte auch zunächst mit der ECM-Komponente von Interesse beschichtet. In der Sphäroid-Mesothelzelle Modellsystem wird die Schnittstelle mit einer Schicht aus Matrigel (siehe Tabelle Materialien für Firmendaten), um die komplexe ECM die Mesothelzellen Auskleidung der Bauchfell zugrunde liegenden imitieren, gefolgt von einem Monolayer der menschlichen Mesothelzellen 'beschichtet Ziel "-Zellen. Schließlich sind die vorgeformten Eierstockkrebs Sphäroiden Anzeigeded. Eierstockkrebs Sphäroid Zellen müssen aktiv durch die Zielzellen Schicht und Matrix eindringen, um die Bodenkammer zu erreichen und elektrische Impedanzmesswerte verändern. Zielzellen allein sind ebenfalls bewertet, um sicherzustellen, dass sie nicht durch die Matrixschicht eindringen und sich in diesem Assay geeignet.
Invasion der Eierstockkrebszellen interagieren mit einer Vielzahl von Zelltypen an der Oberfläche des Bauchfells, einschließlich Fibroblasten, Adipozyten und Mesothelzellen und bidirektionale Kommunikation zwischen den Krebszellen und Peritonealzellen wird gedacht, um eine Schlüsselrolle bei der Vertreibung der metastatischen Prozess 2 zu spielen. Sobald sie beherrscht, ist die hier beschriebene Protokoll leicht an der Untersuchung dieser Wechselwirkungen innerhalb der Bauchmikroumgebung, z. B. durch die Zugabe von exogenen Cytokinen, Wachstumsfaktoren oder spezifischen Inhibitoren auf die oberen oder unteren Kammern des CIM-Platte gut oder Genmanipulation der Krebs oder peritonealen Zelllinien. Darüber hinaus kann diese Methode mit primären Eierstocktumorzellen frisch aus malignem Aszites und / oder primäre Bauch Zellen geerntet, direkte Einblicke in die Regulationssignale und zelluläre Wechselwirkungen, die die Einrichtung einer metastatischen Läsion in der Bauchhöhle regieren zu gewinnen verwendet werden <sbis> 2.
Die Nutzung der RTCA Instrument, um die invasive Kapazität der einzelnen Zellen oder Kügelchen messen bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Einzel Endpunkt-Assays und Bild Zeitraffer-Analysen. Der RTCA Gerät misst Zellinvasion in definierten Abständen kontinuierlich innerhalb eines Assays, die Stunden oder Tage sein kann. Dies ermöglicht die Bestimmung von Änderungen in der Geschwindigkeit der Invasion im Laufe der Zeit, die die Grenzen der einzelnen Endpunkt-Assays überwindet. Beispielsweise die Prüfung der Invasion von Daten aus den verschiedenen Krebszelllinien in einem einzigen Endpunkt (Fig. 2), z. B. 3 Stunden, möglicherweise fehlerhaften Ergebnis, dass KGN und OVCA433 Zellen waren viel invasiv als OVCA429 Zellen geführt. Ein weiterer Vorteil dieser Technologie ist, dass die RTCA Gerät misst Änderungen in der elektrischen Impedanz. Dies bedeutet, dass Tests können ohne Markierung von Zellen mit einer exogenen Mittel, die unbeabsichtigten Auswirkungen auf die Zell phen haben könnte ausgeführt werdenOTYPE oder Funktion. Dies wird besonders wichtig, wenn das Studium primären Eierstockkrebszellen von malignem Aszites, mit dem es zwingend notwendig, um Manipulationen auf ein Minimum zu halten, um zu vermeiden, um die Einführung der molekularen und phänotypischen Veränderungen, die nicht repräsentativ für ihre in vivo Natur 2 abgeleitet. Außerdem Nutzung des RTCA Instrument ermöglicht die Erfassung von quantitativen Daten in Echtzeit, die nicht nur vermeidet die zeitaufwendige Analysen mit Zeitraffer-Mikroskopie verbunden, sondern ermöglicht auch die schnelle Bestimmung von Schlüssel experimentelle Fenster für die Assay-Optimierung. Dies ist besonders nützlich, wenn man die Wirkungen einer Reihe von Faktoren auf Sphäroid Invasion, als unterschiedliche Faktoren ihre maximale Wirkung zu verschiedenen Zeitpunkten oder mit sehr unterschiedlichen Profilen über die Zeit zu nehmen.
Obwohl dieses Protokoll zugänglich Veränderungen (z. B. Verwendung von verschiedenen ECM-Matrix, verschiedenen Krebszelllinien oder andere Ziel celLS), wenn dies so ist, ist es wichtig zu beachten, dass verschiedene Versuchsbedingungen zunächst optimiert werden. Beispielsweise vor Beginn der Studien der Sphäroid-Invasion, die optimale Anzahl von Krebszellen / CIM Platte sollte auch zunächst durch Assay der Zellzahl Titrationen in Monolayer-Kultur bestimmt werden. Die optimale Anzahl von Sphäroiden pro gut gebrauchen wird dann auf dieser Analyse. Beispielsweise in der aktuellen Methode, Sphäroide enthalten etwa 3.000 Zellen jeweils als erstes erzeugt. Wenn Anfangszellzahl Titrationen zeigen, dass 30.000 Zellen in Monolayer sind optimal für die Detektion in Invasion analysiert, dann 10 Sphäroide pro CIM Platte hinzugefügt. Wenn ferner die Durchführung Co-Kultur-Experimente ist es wichtig, das Verhalten der "Ziel"-Zellmonoschicht getrennt, um zu bestimmen, ob diese Zellen sind von Natur aus invasiv, da dies die Ergebnisse verwechseln studieren. In dem Beispiel gezeigt werden Krebs Sphäroide auf der Oberseite eines Zell LP9 Monola plattiertyer, mit und ohne FBS an der Unterseite hinzugefügt sowie ein chemoattractant. Parallel werden LP9 Zellen allein unter jedem Behandlungszustand kultiviert.
Ebenso, wenn die Untersuchung der Invasionskapazität von Zellen und Sphäroiden, ist es auch wichtig, ihre Migrations Kapazitäten, um die beiden Verhaltensweisen (dh Invasion erfordert den proteolytischen Abbau eines ECM-Barriere während der Migration nicht) unterscheiden zu untersuchen als auch. Um dies zu tun, lassen Sie den ECM-Schranke (Schritte 3.1.1 – 3.1.3) und führen den Test parallel mit der ECM-Barriere im Ort. Letztere "Invasion" Maßnahme kann auf der ehemaligen "Migration" Maß korrigiert werden, falls gewünscht. Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass die Informationen aus Maßnahmen der elektrischen Impedanz gewonnen begrenzten: einmal Zellen in der unteren Kammer eingedrungen, können Veränderungen in ihrer Befestigung, Verbreitung, und Proliferation auf der Unterseite der Membran auf Veränderungen beitragen Impedanz reaDellen. Daher ist diese Methode sehr informativ, wenn sie in Verbindung mit anderen Tests der Sphäroid Zelllebensfähigkeit, Adhäsion, Migration und Morphologie, um umfassend zu beurteilen Sphäroid Zellverhalten verwendet. Zum Beispiel ideal, um die Sphäroid-mesothelial Wechselwirkungen zu verstehen, separaten Co-Kulturen sollte auch in regelmäßigen Abständen unter Standard-Phasenmikroskopie abgebildet werden, so dass qualitative Beurteilungen der Sphäroid Morphologie und Gesundheit können parallel mit quantitativen Assays RTCA der Invasion gemacht werden. Wenn das optionale Markierungsschritt durchgeführt wird, dann werden die Verhaltensweisen der einzelnen Krebszellen unter Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden, da sie von der Sphäroid zerlegen und interagieren mit den unmarkierten Mesothelzellen. Ein zusätzlicher Vorteil der Fluoreszenzmarkierung, die Krebszellen bei Co-Kultivierung mit einem zweiten Zelltyp ist, dass es dann möglich, zu bestätigen, dass nur die Krebszellen durch die Zelle und ECM Barrieren fallen.
<p class="jove_content"> Zusammenfassend stellt diese Methode einen hohen Durchsatz quantitative Analyse von Eierstockkrebs Sphäroid Invasion der Mesothelzellen und ECM-Barrieren. Durch die Zugabe von exogenen Zytokinen, Wachstumsfaktoren, oder spezifische Inhibitoren zu den oberen oder unteren Kammern des CIM-Platte gut, ermöglicht diese Methode eine schnelle Bestimmung von Faktoren, die die Wechselwirkungen zwischen Eierstockkrebs-Zellen eindringende Sphäroid durch Mesothelzellen und Matrixbarrieren über Regulierung Zeit.The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch eine CASS Stiftung Wissenschaft und Medizin Zuschuss unterstützt; (MB); a National Health & Medical Research Council of Australia Projekt Grant (KLS, 338516); und von der Regierung von Victoria Operational Infrastructure Support Program (Australien).
xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
Methylcellulose (4000 centipose) | Sigma | M0512 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |