Un metodo semplice ed efficace per rilevare l'attivazione del Fattore Nucleare in neutrofili umani mediante citometria a flusso
Summary
I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nel sangue. Neutrofili possiedono funzioni trascrizionalmente regolate, quali la produzione di citochine pro-infiammatorie e l'inibizione di apoptosi. Queste funzioni possono essere studiati con il metodo presentato qui, che consente il rilevamento e la quantificazione dei fattori nucleari mediante citometria a flusso in nuclei isolati
Abstract
I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nel sangue periferico. Queste cellule sono i primi a comparire nei siti di infiammazione e infezione, diventando così la prima linea di difesa contro l'invasione dei microrganismi. Neutrofili possiedono importanti funzioni antimicrobici come fagocitosi, il rilascio di enzimi litici, e la produzione di specie reattive dell'ossigeno. Oltre a queste funzioni di difesa importanti, neutrofili svolgere altri compiti in risposta alle infezioni come la produzione di citochine proinfiammatorie e inibizione di apoptosi. Le citochine reclutare altri leucociti che aiutano a eliminare l'infezione, e l'inibizione di apoptosi dei neutrofili permette di vivere più a lungo nel sito di infezione. Queste funzioni sono regolate a livello di trascrizione. Tuttavia, poiché i neutrofili sono cellule di breve durata, lo studio delle risposte trascrizionalmente regolati in queste cellule non può essere eseguita con metodi convenzionali geni reporter in quanto non sono effitecniche cienti per la trasfezione dei neutrofili. Qui, presentiamo un metodo semplice ed efficace che permette la rilevazione e la quantificazione dei fattori nucleari in nuclei isolati e immunolabeled mediante citometria a flusso. Si descrivono tecniche per isolare neutrofili pure da sangue periferico umano, stimolare queste cellule con anticorpi anti-recettore, isolare e nuclei immunolabel, e analizzare nuclei mediante citometria a flusso. Il metodo è stato utilizzato con successo per rilevare NF-KB e Elk-1 fattori nucleari in nuclei di neutrofili e altri tipi di cellule. Pertanto, questo metodo rappresenta un'opzione per analizzare l'attivazione di fattori di trascrizione in nuclei isolati da una varietà di tipi cellulari.
Introduction
I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nel sangue periferico 1. Durante neutrofili infiammazione e l'infezione sono le prime cellule a comparire presso il sito interessato dove agiscono come prima linea di difesa 2. Neutrofili possiedono diversi meccanismi antimicrobici 3 tra cui la fagocitosi, la produzione di specie reattive dell'ossigeno, rilascio di enzimi litici di degranulazione, e la produzione di citochine proinfiammatorie 4,5. I neutrofili sono di breve durata cellule che vengono rapidamente attivati tramite segnalazione da vari recettori della superficie cellulare. Sebbene neutrofili sono state considerate cellule terminali a causa della loro breve vita e perché subiscono apoptosi meno attiva durante il processo infiammatorio 6, è chiaro che possono anche modificare il loro fenotipo cambiando il livello di trascrizione di geni specifici. La produzione di citochine 5 e l'inibizione dell'apoptosi 7,8 sono due importante attivazione-dipendente funzioni cellulari regolati a livello di trascrizione dei neutrofili. Fattore nucleare kB (NF-kB) partecipa al controllo trascrizionale del 4 citochine produzione e nella regolazione della sopravvivenza cellulare e apoptosi 9-11 in vari tipi di cellule.
Le vie di segnalazione che portano alla attivazione del fattore nucleare sono di solito studiati da saggi reporter gene o da saggi elettroforetici spostamento di mobilità (EMSA). Tuttavia, poiché i neutrofili sono cellule di breve durata, lo studio delle risposte trascrizionalmente regolati in queste cellule non possono essere eseguite con saggi reporter gene, poiché non ci sono tecniche efficienti per la transfezione neutrofili. Saggi EMSA sono stati utilizzati in neutrofili per esplorare l'attivazione del fattore nucleare 12,13, tuttavia, questa metodologia è complicato e costoso in quanto prevede l'utilizzo di materiale radioattivo. Nucleofection è un'altra tecnica che è stata utilizzata successfully per trasfettare monociti 14. Così, almeno in teoria, attivazione del fattore nucleare potrebbe essere rilevato in neutrofili di trasfezione (nonostante bassa efficienza). Tuttavia, questa tecnica sarebbe più costoso, richiede tempo e probabilmente meno quantitativa. Analisi microscopica delle cellule immunocolorate potrebbe anche essere utilizzato per rilevare fattori nucleari nel nucleo. Abbiamo infatti rilevato NF-kB traslocazione nel nucleo in questo modo 15. Sfortunatamente, questa tecnica è anche tempo, meno quantitativi, e soggetti a bias dell'osservatore.
Qui, presentiamo un metodo semplice ed efficace che permette la rilevazione e la quantificazione dei fattori nucleari in nuclei isolati e immunolabeled mediante citometria a flusso. Si descrivono tecniche per isolare neutrofili dal sangue periferico umano, stimolare queste cellule via integrine o recettori Fc con anticorpi anti-recettore, isolare e nuclei immunolabel, e analizzare nuclei mediante citometria a flusso (Figura 1). Il metodo è stato utilizzato con successo per rilevare NF-KB 15 e Elk-1 16 fattori nucleari nei nuclei dei neutrofili. La sensibilità di questo metodo consente la rilevazione di piccole variazioni di livelli di fattori nucleari nel nucleo. Questo metodo può anche essere usato per analizzare il livello di fattori di trascrizione in nuclei da altri tipi di cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo di purificazione descritto permette l'isolamento dei neutrofili non stimolati (PMN) con purezza superiore al 95% (valutata mediante osservazione al microscopio), in breve tempo. Talvolta neutrofili possono essere contaminati da eritrociti se questi non sono completamente lisati. Questo di solito non pregiudica la tecnica, gli eritrociti e PMN può essere facilmente distinto come distinte popolazioni cellulari mediante citometria a flusso. PMN isolato può essere stimolato da recettori reticolazione partico…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Nancy Mora per la sua assistenza tecnica.
Questo lavoro è stato finanziato da borse di ricerca 48573-M e 168.098 dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Messico, e da sovvenzioni IN212308 e IN205311-2 da Dirección General de Asuntos del Personale Academico, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Messico.
Materials
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur |
Referencias
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
- Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
- Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Molecular control of neutrophil apoptosis. FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
- Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
- Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
- Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
- Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
- Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).
