Um método simples e eficiente para detectar ativação do fator nuclear em neutrófilos humanos por citometria de fluxo
Summary
Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue. Os neutrófilos possuem funções transcricionalmente regulados tais como a produção de citocinas pró-inflamatórias e inibição da apoptose. Estas funções podem ser estudadas com o método aqui apresentado, o que permite a detecção e quantificação dos factores nucleares por citometria de fluxo em núcleos isolados
Abstract
Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico. Estas células são os primeiros a aparecer nos locais de inflamação e à infecção, tornando-se a primeira linha de defesa contra microorganismos invasores. Os neutrófilos possuem importantes funções antimicrobianas, tais como fagocitose, a libertação de enzimas líticas e produção de espécies reactivas de oxigénio. Em adição às funções de defesa importantes, os neutrófilos realizar outras tarefas, em resposta à infecção, tais como a produção de citocinas pró-inflamatórias e inibição da apoptose. Citocinas recrutar outros leucócitos que ajudam a eliminar a infecção, e a inibição da apoptose permite que o neutrófilo de viver mais tempo no local da infecção. Estas funções são reguladas ao nível da transcrição. No entanto, porque os neutrófilos são células de vida curta, o estudo das respostas transcricionalmente regulados nestas células não pode ser realizada com métodos convencionais de gene repórter já que não há eficientes para técnicas de transfecção de neutrófilos. Aqui, apresentamos um método simples e eficiente, que permite a detecção e quantificação de fatores nucleares em núcleos isolados e immunolabeled por citometria de fluxo. Descrevemos técnicas para isolar puros a partir de neutrófilos de sangue periférico humano, estimular estas células com anti-anticorpos do receptor, isolar e núcleos immunolabel, e analisar os núcleos por citometria de fluxo. O método tem sido utilizado com sucesso para detectar a NF-kB e Elk-1 factores nucleares de núcleos a partir de neutrófilos e de outros tipos de células. Assim, este método representa uma opção para a análise de activação de factores de transcrição no núcleo isolado a partir de uma variedade de tipos de células.
Introduction
Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico 1. Durante neutrófilos inflamação e infecção são as primeiras células a aparecer no local afetado, onde eles agem como a primeira linha de defesa 2. Neutrófilos possuem vários mecanismos, incluindo antimicrobianos 3 fagocitose, produção de espécies reativas de oxigênio, liberação de enzimas líticas pela degranulação e produção de citocinas pró-inflamatórias 4,5. Os neutrófilos são células de curta duração que são rapidamente ativadas através de sinalização de receptores de superfície vários celulares. Embora os neutrófilos foram consideradas células de terminal, devido à sua curta vida e porque eles sofrem apoptose, a menos que activada durante o processo inflamatório 6, é agora evidente que pode também modificar o seu fenótipo, alterando o nível de transcrição de genes específicos. A produção de citocinas 5 e a inibição da apoptose 7,8 são dois important funções de activação dependentes de células reguladas ao nível da transcrição dos neutrófilos. Factor nuclear kB (NF-kB) participa no controlo transcricional da produção de citoquina e 4 na regulação da sobrevivência celular e apoptose 9-11 em vários tipos de células.
As vias de sinalização que levam à ativação do fator nuclear são estudados por ensaios de gene repórter ou por ensaios de mobilidade eletroforética turno (EMSA). No entanto, porque os neutrófilos são células de vida curta, o estudo das respostas transcricionalmente regulados nestas células não pode ser realizada com os ensaios de gene repórter, uma vez que não existem técnicas eficazes para a transfecção de neutrófilos. Ensaios de EMSA foram usados em neutrófilos para explorar activação do factor nuclear 12,13, no entanto, esta metodologia é complicada e dispendiosa uma vez que envolve a utilização de material radioactivo. Nucleofection é uma outra técnica que tem sido utilizada successfully para transfectar monócitos 14. Assim, pelo menos em teoria, a activação do factor nuclear pode ser detectado nos neutrófilos por transfecção (apesar de baixa eficiência). No entanto, esta técnica poderia ser mais dispendioso, demorado e provavelmente menos quantitativo. A análise microscópica de células imunomarcadas também poderia ser usado para detectar factores nucleares no núcleo. Com efeito, temos detectado translocação de NF-kB para o núcleo deste modo 15. Infelizmente, esta técnica também é demorada, menos quantitativos, e sujeita a viés do observador.
Aqui, apresentamos um método simples e eficiente, que permite a detecção e quantificação de fatores nucleares em núcleos isolados e immunolabeled por citometria de fluxo. Descrevemos técnicas para isolar os neutrófilos a partir de sangue periférico humano, estimular estas células via integrinas ou receptores de Fc com anti-anticorpos do receptor, isolar e núcleos immunolabel, e analisar os núcleos por citometria de fluxo (Figura 1). O método tem sido utilizado com sucesso para detectar a NF-kB 15 e Elk-1 16 factores nucleares de núcleos de neutrófilos. A sensibilidade deste método permite a detecção de pequenas mudanças nos níveis do factor nuclear no núcleo. Este método também pode ser utilizado para analisar o nível de factores de transcrição no núcleo de outros tipos de células.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método de purificação descrito aqui permite o isolamento dos neutrófilos não estimulados (PMN) com pureza superior a 95% (avaliada por observação microscópica), num curto período de tempo. Por vezes, os neutrófilos podem ser contaminados por eritrócitos, se este não estiver completamente lisadas. Isso geralmente não afetam a técnica, uma vez que os eritrócitos e PMN pode facilmente ser distinguido como populações de células distintas por citometria de fluxo. PMN isolado pode então ser estimulada pel…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Nancy Mora por sua assistência técnica.
Este trabalho foi financiado por bolsas de investigação 48573-M e 168098 do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, do México, e por doações e IN212308 IN205311-2 da Dirección General de Asuntos del Academico Pessoal, Universidad Nacional Autónoma de México, México.
Materials
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur |
Referencias
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
- Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
- Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Molecular control of neutrophil apoptosis. FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
- Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
- Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
- Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
- Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
- Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).
