Une méthode simple et efficace pour détecter l'activation du facteur nucléaire dans les neutrophiles humains par cytométrie en flux
Summary
Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans le sang. Les neutrophiles possèdent des fonctions transcription régulés tels que la production de cytokines pro-inflammatoires et l'inhibition de l'apoptose. Ces fonctions peuvent être étudiés avec la méthode présentée ici, qui permet la détection et la quantification des facteurs nucléaires par cytométrie en flux dans les noyaux isolés
Abstract
Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans le sang périphérique. Ces cellules sont les premiers à apparaître sur les sites de l'inflammation et de l'infection, devenant ainsi la première ligne de défense contre les micro-organismes envahisseurs. Les neutrophiles possèdent d'importantes fonctions antimicrobiennes tels que la phagocytose, la libération d'enzymes lytiques, et la production d'espèces réactives de l'oxygène. En plus de ces fonctions de défense importants, les neutrophiles effectuer d'autres tâches en réponse à l'infection, comme la production de cytokines pro-inflammatoires et l'inhibition de l'apoptose. Cytokines recruter d'autres leucocytes qui aident à éliminer l'infection, et l'inhibition de l'apoptose des neutrophiles permet de vivre plus longtemps sur le site de l'infection. Ces fonctions sont réglementés au niveau de la transcription. Cependant, parce que les neutrophiles sont des cellules de courte durée, l'étude des réponses transcriptionnellement réglementées dans ces cellules ne peuvent pas être effectuées avec les méthodes classiques de gènes rapporteurs puisqu'il n'y a pas effitechniques santes pour la transfection des neutrophiles. Ici, nous présentons une méthode simple et efficace qui permet la détection et la quantification des facteurs nucléaires dans des noyaux isolés et immunomarquées par cytométrie en flux. Nous décrivons les techniques pour isoler les neutrophiles purs à partir de sang périphérique humain, de stimuler ces cellules avec des anticorps anti-récepteurs, d'isoler et de noyaux immunolabel, et d'analyser les noyaux par cytométrie en flux. La méthode a été utilisée avec succès pour détecter NF-kB et Elk-1 facteurs nucléaires dans les noyaux des neutrophiles et d'autres types cellulaires. Ainsi, cette méthode représente une option pour analyser l'activation des facteurs de transcription dans des noyaux isolés à partir d'une variété de types de cellules.
Introduction
Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans le sang périphérique 1. Au cours de neutrophiles inflammation et l'infection sont les premières cellules à apparaître sur le site touchée où ils agissent comme première ligne de défense 2. Les neutrophiles possèdent plusieurs mécanismes antimicrobiens 3, notamment la phagocytose, production d'espèces réactives de l'oxygène, la libération d'enzymes lytiques par la dégranulation et la production de cytokines pro-inflammatoires 4,5. Les neutrophiles sont des cellules de courte durée qui se rapidement activés par la signalisation de divers récepteurs de surface cellulaire. Bien que les neutrophiles ont été considérés cellules terminales en raison de leur courte durée de vie et parce qu'ils subissent une apoptose à moins activées pendant le processus inflammatoire 6, il est maintenant clair qu'ils peuvent également modifier leur phénotype en changeant le niveau de la transcription de gènes particuliers. La production de cytokines 5 et l'inhibition de l'apoptose 7,8 sont deux important fonctions cellulaires dépendant de l'activation régulée au niveau de la transcription dans les cellules neutrophiles. Le facteur nucléaire kB (NF-kB) participe à la régulation transcriptionnelle de 4 la production de cytokines et dans la régulation de la survie cellulaire et l'apoptose 9-11 dans différents types cellulaires.
Les voies de signalisation qui conduisent à l'activation du facteur nucléaire sont habituellement étudiées par des essais de gène rapporteur ou par électrophorèse des essais de décalage de mobilité (EMSA). Cependant, parce que les neutrophiles sont des cellules de courte durée, l'étude des réponses transcription régulés dans ces cellules ne peuvent pas être réalisées avec des dosages de gènes rapporteurs, car il n'existe pas de techniques efficaces pour la transfection des neutrophiles. Analyses EMSA ont été utilisés dans les neutrophiles d'explorer l'activation du facteur nucléaire 12,13; toutefois, cette méthode est compliquée et coûteuse car elle implique l'utilisation de matières radioactives. Nucléofection est une autre technique qui a été utilisée successfully pour transfecter monocytes 14. Ainsi, au moins en théorie, l'activation du facteur nucléaire a pu être détectée dans les neutrophiles par transfection (malgré la faible efficacité). Cependant, cette technique serait plus coûteux, fastidieux et probablement moins quantitative. L'analyse microscopique des cellules immunocolorées pourrait également être utilisé pour détecter les facteurs nucléaires dans le noyau. En effet, nous avons détecté une translocation de NF-kB dans le noyau de cette façon 15. Malheureusement, cette technique est aussi beaucoup de temps, moins quantitative, et sujettes à des biais de l'observateur.
Ici, nous présentons une méthode simple et efficace qui permet la détection et la quantification des facteurs nucléaires dans des noyaux isolés et immunomarquées par cytométrie en flux. On décrit des techniques pour isoler des neutrophiles du sang périphérique humain, stimuler ces cellules par l'intermédiaire des intégrines ou des récepteurs Fc avec des anticorps anti-récepteurs, d'isoler et de noyaux immunolabel, et analyser les noyaux par cytométrie de flux (Figure 1). La méthode a été utilisée avec succès pour détecter NF-kB 15 et Elk-1 16 facteurs nucléaires dans les noyaux des neutrophiles. La sensibilité de cette méthode permet la détection de petits changements dans les niveaux de facteurs nucléaires dans le noyau. Cette méthode peut également être utilisée pour analyser le niveau des facteurs de transcription dans le noyau à partir d'autres types cellulaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le procédé de purification décrit ici permet d'isoler les neutrophiles non stimulés (PMN) de pureté supérieure à 95% (évaluée par l'observation microscopique), dans un court laps de temps. Parfois, les neutrophiles peuvent être contaminés par les érythrocytes si celui-ci ne sont pas lysées complètement. Cela ne devrait pas nuire à la technique, les érythrocytes et les PMN peuvent facilement être distingués comme des populations cellulaires distinctes par cytométrie en flux. PMN isolé peut ens…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Nancy Mora pour son assistance technique.
Ce travail a été financé par des subventions de recherche 48573-M et 168098 du Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, au Mexique, et par des subventions IN212308 et IN205311-2 à partir de Dirección General de Asuntos del Personal Academico, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, au Mexique.
Materials
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur |
Referencias
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
- Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
- Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Molecular control of neutrophil apoptosis. FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
- Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
- Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
- Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
- Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
- Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).
