Summary

Las mitocondrias asociadas ER membranas (MAM) y glicoesfingolípidos microdominios enriquecidos (GEMS): Aislamiento de cerebro de ratón

Published: March 04, 2013
doi:

Summary

Este procedimiento muestra cómo aislar del cerebro del ratón adulto las membranas de las mitocondrias ER-asociados o mams y los glucoesfingolípidos fracciones enriquecidas microdominio de MAM y preparaciones mitocondriales.

Abstract

Orgánulos intracelulares son estructuras altamente dinámicas con diferentes forma y composición, que son sometidos a células específicas de señales intrínsecas y extrínsecas. Sus membranas son a menudo yuxtapuestos en sitios de contacto definidas, que se convierten en los cubos para el intercambio de moléculas de señalización y los componentes de membrana 1,2,3,4. Los inter-organellar microdominios de membrana que se forman entre el retículo endoplasmático (ER) y la mitocondria en la apertura de la Ca IP3-2 sensible son conocidos canal + como las mitocondrias asociado-ER membranas o MAMS 4,5,6. La composición de proteína / lípido y propiedades bioquímicas de estos sitios de membrana de contacto han sido ampliamente estudiados en particular en relación con su papel en la regulación intracelular de Ca 2 + 4,5,6. El ER sirve como el almacén principal de la concentración de Ca 2 +, y en esta capacidad regula una gran variedad de procesos celulares aguas abajo de Ca 2 + señalización, including post-traduccional plegamiento de la proteína y proteína maturation7. Las mitocondrias, por otra parte, mantener la homeostasis del Ca 2 +, por la precarga de concentración citosólica de Ca 2 + evitando de este modo la iniciación de las vías de apoptosis aguas abajo de Ca 2 + desequilibrio 4,8. La naturaleza dinámica de los mames hace sitios ideales para diseccionar los mecanismos básicos celulares, incluyendo Ca 2 + señalización y regulación mitocondrial de Ca 2 + concentración supervivencia, la biosíntesis de lípidos y el transporte, la energía y el metabolismo celular 4,9,10,11,12. Varios protocolos se han descrito para la purificación de estos microdominios de tejido hepático y células cultivadas 13,14.

Tomando los métodos publicados anteriormente en cuenta, se ha adaptado un protocolo para el aislamiento de las mitocondrias y MAM desde el cerebro de ratón adulto. Para este procedimiento se ha agregado una etapa de purificación adicional, a saber, una extracción de Triton X100, que enables el aislamiento de la glicoesfingolípido enriquecido microdominio (GEM) de la fracción de los mames. Estas preparaciones GEM comparten varios componentes de proteínas con balsas caveolas y lípidos, derivados de la membrana de plasma u otras membranas intracelulares, y se proponen para funcionar como puntos de encuentro para el agrupamiento de proteínas receptoras y para las interacciones proteína-proteína 4,15.

Protocol

El siguiente protocolo está diseñado para el aislamiento y purificación de MAM y gemas de cerebro de ratón Soluciones necesario para el aislamiento de las mitocondrias, MAM y gemas Fraccionamiento de obtener preparación mitocondrial crudo: Solución A: 0,32 M sacarosa, 1 mM NaHCO 3, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl 2 + Inhibidores de la proteasa (añada fresca, según sea necesario) </…

Representative Results

Basándonos en nuestra experiencia con el uso de este protocolo con seguridad puedo recomendar para el aislamiento y purificación de MAM, gemas y fracciones mitocondriales de cerebro de ratón. El procedimiento presentado es altamente reproducible y consistente. En la Figura 1 se muestra una imagen representativa de la forma pura capa de mitocondrias y MAM en un gradiente de Percoll (paso 3,4). De una banda definida, lechoso que contiene purificó mitocondrias (Mito-P) se segrega en la parte inferior d…

Discussion

Los sitios de contacto entre las membranas intracelulares o entre orgánulos y la membrana plasmática de las células dinámicas representan plataformas de señalización para los procesos celulares básicos. La caracterización exacta de su función y composición, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas requiere protocolos de purificación fiables y reproducibles. Los métodos detallados aquí han sido específicamente optimizada por nuestro laboratorio para el aislamiento y purificación de los MAM y su…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Reconocemos la contribución de Renata Sano en la concepción del protocolo inicial. Ad'A. contiene los joyeros de la Infancia (JFC) Cátedra de Genética y Terapia Génica. Este trabajo fue financiado en parte por el NIH subvenciones GM60905, DK52025 y CA021764, y los americanos libaneses Caridades sirios asociados (ALSAC).

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
REAGENTS
Fractionation
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S-5761
Magnesium Chloride, Hexahydrate Fisher Scientific BP214-500
Calcium Chloride, Dihydrate Sigma-Aldrich C-5080
MAM
D-Mannitol Sigma-Aldrich M9546-250G
Hepes Fisher Scientific BP310-500
EGTA Sigma-Aldrich E4378-250G
BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate Roche 03-116-964-001
Percoll GE 17-0891-02
GEM
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500 ml
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Tris Base Roche 03-118-142-001
HCl Fisher Scientific A144S-500
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500
Common
Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free Roche 11-873-580-001
EQUIPMENT
2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders Kimble Chase 885300-0002
15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon BD 352097
30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-30
15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-15
Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14×89 mm Beckman-Coulter 344059
Parafilm Cole-Parmer PM996
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9″ Fisher Scientific 13-678-20C

Referencias

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Citar este artículo
Annunziata, I., Patterson, A., d’Azzo, A. Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain. J. Vis. Exp. (73), e50215, doi:10.3791/50215 (2013).

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