Summary

ミトコンドリア関連のER膜(MAMS)とスフィンゴ糖脂質マイクロドメインエンリッチド(GEMS):マウス脳から単離

Published: March 04, 2013
doi:

Summary

この手順では、成体マウスの脳ミトコンドリア関連のER膜またはMAMSとMAMSとミトコンドリア調製物からスフィンゴ糖脂質に富むマイクロドメイン画分から単離する方法を示しています。

Abstract

細胞内小器官は、細胞特異的内因性および外因性の刺激にさらされる形状および組成を変化させると非常にダイナミックな構造です。その膜は、しばしば、シグナル伝達分子や膜成分1,2,3,4の交換のためのハブとなって定義されている接触部位で並置されている。 IP3は敏感なCa 2 +チャネルの開口部には小胞体(ER)とミトコンドリアの間に形成されている間オルガネラ膜マイクロドメインは、ミトコンドリア関連する- ER膜またはMAMS 4,5,6として知られている。タンパク質/脂質組成およびこれらの膜の接触部位の生化学的特性は、広範囲に、特に細胞内Ca 2 + 4,5,6の調節におけるそれらの役割に関連して研究されてきた。 ERは、細胞内Ca 2 +の主な店舗となっており、この容量で下流のCa 2の細胞プロセスの無数+シグナル、税込を調節翻訳後のタンパク質の折りたたみ及びタンパク質maturation7をuding。ミトコンドリアは、その一方で、それによって下流のCa 2 +のアンバランス4,8のアポトーシス経路の開始を防止する細胞内Ca 2 +濃度をバッファリングすることにより、Ca 2 +の恒常性を維持する。 MAMSの動的な性質は、それらの理想的なサイトは、Ca 2 +シグナル伝達とミトコンドリアのCa 2 +濃度、脂質生合成と輸送、エネルギー代謝と細胞生存4,9,10,11,12の調節など、基本的な細胞メカニズムを解剖することができます。いくつかのプロトコルが、肝組織および培養細胞13,14からこれらのマイクロドメインの精製の ​​ために記載されている。

アカウントに以前に公開されている方法を取って、我々は、成体マウスの脳からミトコンドリアとMAMSを単離するためのプロトコルを適応している。この手順に、我々はどの電子すなわち余分な精製工程、トリトンX100の抽出を追加しましたnables MAMSのスフィンゴ糖脂質に富んだマイクロドメイン(GEM)の画分の単離。これらのGEMの製剤は、原形質膜または他の細胞内膜に由来し、カベオラや脂質ラフトといくつかのタンパク質成分を共有しており、受容体タンパク質のクラスタリングのために、タンパク質-タンパク質相互作用4,15の集まるポイントとして機能するように提案されている。

Protocol

以下のプロトコールは、マウスの脳からMAMSや宝石の単離および精製のために意図されているミトコンドリア、MAMSや宝石の分離に必要なソリューション原油ミトコンドリアの準備を取得するための分別: ソリューション:0.32Mスクロース、1mMのNaHCO 3を 、1mMのMgCl 2、0.5 mMのCaCl 2 +プロテアー?…

Representative Results

このプロトコルを使用しているとの経験に基づいて、我々は安全MAMS、宝石、マウス脳のミトコンドリア画分の単離および精製のためにそれをお勧めすることができます。概説された手順は、非常に再現性があり、一貫性があります。 図1に我々は、パーコール勾配(ステップ3.4)上の方法で純粋なミトコンドリアとMAMS層の代表的なイメージを示しています。 MAMのフラクションは…

Discussion

細胞内膜間または細胞小器官や細胞の細胞膜との間の接触部位は、基本的な細胞プロセスのためのダイナミックシグナリングプラットフォームを表します。生理学的および病理学の両方の条件下でその機能と組成の正確な特性評価には信頼性と再現性の高い精製プロトコルを必要とします。ここで詳述した方法は、特に成体マウスの脳からMAMSとそれらに対応する宝石の単離および精製のため…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は最初のプロトコルを妊娠中レナータ佐野の貢献を認める。 Ad'A。遺伝学と遺伝子治療に寄附チルドレン(JFC)のために宝石を保持しています。この作品は、NIHの助成金GM60905、DK52025とCA021764、アメリカレバノンシリア関連慈善団体(ALSAC)によって部分的に資金を供給された。

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
REAGENTS
Fractionation
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S-5761
Magnesium Chloride, Hexahydrate Fisher Scientific BP214-500
Calcium Chloride, Dihydrate Sigma-Aldrich C-5080
MAM
D-Mannitol Sigma-Aldrich M9546-250G
Hepes Fisher Scientific BP310-500
EGTA Sigma-Aldrich E4378-250G
BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate Roche 03-116-964-001
Percoll GE 17-0891-02
GEM
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500 ml
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Tris Base Roche 03-118-142-001
HCl Fisher Scientific A144S-500
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500
Common
Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free Roche 11-873-580-001
EQUIPMENT
2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders Kimble Chase 885300-0002
15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon BD 352097
30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-30
15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-15
Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14×89 mm Beckman-Coulter 344059
Parafilm Cole-Parmer PM996
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9″ Fisher Scientific 13-678-20C

Referencias

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Annunziata, I., Patterson, A., d’Azzo, A. Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain. J. Vis. Exp. (73), e50215, doi:10.3791/50215 (2013).

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