Summary

Митохондрии связанных ER мембран (MAMS) и гликосфинголипид Обогащенный микродоменов (ГЭУ): Изоляция от мозга мыши

Published: March 04, 2013
doi:

Summary

Эта процедура показывает, как можно изолировать от мозга взрослого человека мышью митохондрий связанных ER мембран или MAMS и гликосфинголипид обогащенного микродоменной фракций из MAMS и митохондриальных препаратов.

Abstract

Внутриклеточных органелл очень динамических структур с различной формой и составом, которые подвергаются клетки конкретных внутренних и внешних сигналов. Их мембраны часто сопоставляется в определенные контакты сайтов, которые становятся центрами для обмена сигнальными молекулами и мембранных компонентов 1,2,3,4. Между органелл мембраны микродоменов, которые образуются между эндоплазматической сети (ER) и митохондрий на открытии IP3 чувствительные Са 2 + каналов известны как митохондрии, связанный-ER мембран или MAMS 4,5,6. Белка / липидного состава и биохимических свойств этих сайтов мембранных контактов были тщательно изучены особенности в отношении их роль в регуляции внутриклеточного Ca 2 + 4,5,6. ER служит в качестве основного магазина внутриклеточного Ca 2 +, и в этом качестве регулирует множество клеточных процессов вниз по течению от Ca 2 + сигнализации, в т.ч.uding посттрансляционных складывающиеся белка и maturation7. Митохондрии, с другой стороны, поддерживать Ca 2 + гомеостаз, путем буферизации цитозольной концентрации Са 2 + предотвращая тем самым начало апоптоза вниз по течению от Ca 2 + 4,8 дисбаланса. Динамичный характер MAMS делает их идеальными сайтов препарировать основных клеточных механизмов, в том числе Ca 2 + сигнализация и регулирование митохондриальных концентрации Са 2 +, биосинтез липидов и транспорта, энергетического метаболизма и выживания клеток 4,9,10,11,12. Несколько протоколов были описаны для очистки этих микродоменов из ткани печени и культивируемых клеток 13,14.

Принимая ранее опубликованных методов во внимание, мы адаптировали протокол для выделения митохондрий и MAMS от взрослого мозга мыши. Для этой процедуры мы добавили дополнительный этап очистки, а именно добыча Triton X100, который электроннойnables изоляции гликосфинголипид обогащенного микродоменной (GEM) доля MAMS. Эти GEM препараты имеют ряд белковых компонентов с кавеол и липидного плоты, полученных от плазматической мембраны или других внутриклеточных мембран, и предложил работать как сборные пункты для кластеризации рецепторных белков и белок-белковых взаимодействий 4,15.

Protocol

Следующий протокол предназначен для выделения и очистки MAMS и драгоценных камней из мозга мыши Решения необходимы для изоляции митохондрий, MAMS и драгоценных камней Фракционирования для получения сырого митохондриальной подготовки: <stron…

Representative Results

Основываясь на нашем опыте с использованием этого протокола мы можем смело рекомендовать его для выделения и очистки MAMS, драгоценных камней и митохондриальной фракции мозга мыши. Процедура, как описано очень воспроизводимые и последовательным. На рисунке 1 мы показываем пред…

Discussion

Места контакта между внутриклеточных мембран или между органелл и плазматической мембраны клетки представляют динамические сигнализации платформы для основных клеточных процессах. Точную характеристику их функции и состав под обоими физиологических и патологических условиях треб…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы признаем вклад Рената Сано с зачатием начального протокола. Ad'A. держит Ювелиры для детей (JFC) Наделенный кафедры генетики и генной терапии. Эта работа была частично финансируется за счет грантов NIH GM60905, DK52025 и CA021764, и американский ливанских сирийских Associated благотворительности (ALSAC).

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
REAGENTS
Fractionation
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S-5761
Magnesium Chloride, Hexahydrate Fisher Scientific BP214-500
Calcium Chloride, Dihydrate Sigma-Aldrich C-5080
MAM
D-Mannitol Sigma-Aldrich M9546-250G
Hepes Fisher Scientific BP310-500
EGTA Sigma-Aldrich E4378-250G
BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate Roche 03-116-964-001
Percoll GE 17-0891-02
GEM
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500 ml
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Tris Base Roche 03-118-142-001
HCl Fisher Scientific A144S-500
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500
Common
Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free Roche 11-873-580-001
EQUIPMENT
2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders Kimble Chase 885300-0002
15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon BD 352097
30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-30
15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-15
Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14×89 mm Beckman-Coulter 344059
Parafilm Cole-Parmer PM996
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9″ Fisher Scientific 13-678-20C

Referencias

  1. Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
  2. Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
  3. Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
  4. Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d’Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
  5. Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
  6. Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
  7. d’Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
  8. Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
  9. Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
  10. Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
  11. Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
  12. Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
  13. Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
  14. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
  15. Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).

Play Video

Citar este artículo
Annunziata, I., Patterson, A., d’Azzo, A. Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain. J. Vis. Exp. (73), e50215, doi:10.3791/50215 (2013).

View Video