在这份报告中,我们描述了一个隔离高度纯化的白细胞浸润肿瘤人口的协议。该协议是改编自美天旎生物技术协议,以提高产量和隔离从复杂的肿瘤组织细胞的纯度。
肿瘤创造出独特的免疫微环境(TME),肿瘤微环境,使白细胞招募到肿瘤的各种趋化因子和生长因子1,2。然而,一旦在屯门东,这些细胞失去的能力,以促进抗肿瘤免疫,并开始支持肿瘤的生长和下调抗肿瘤免疫反应3-4。肿瘤相关白细胞的研究主要集中在细胞分离肿瘤引流淋巴结或脾脏由于从原发肿瘤获得足够的细胞数量和纯度的固有困难。同时确定细胞活化和贩运的机制,通过对荷瘤小鼠的淋巴系统是重要的,可能会给了解癌症的免疫反应动力学,在我们的经验,很多白细胞,包括树突状细胞,肿瘤引流淋巴结有不同的表型,肿瘤浸润5,6比。此外,我们先前已经表明,继转移分离的T细胞肿瘤淋巴结不tolerized能够应对不同的TME分离的T细胞,这是增殖或细胞因子tolerized和无能的体外二次刺激生产7,8。有趣的是,我们已经表明,改变肿瘤微环境,如提供的CD4 +辅助性T细胞通过过继转移,促进CD8 + T细胞维持促炎效应功能5。从前面提到的研究结果表明测量从TME浸润免疫细胞的细胞反应,而不是留在外围的细胞的重要性。学习使用9天旎生物隔离系统渗入肿瘤的免疫细胞的功能,我们已经修改和优化基于这种抗体的隔离程序,以获取高é抗原呈递细胞和肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞nriched人口。该协议包括从一个自发的前列腺肿瘤模型(腺癌转基因老鼠的前列腺的流浪汉)10和皮下黑色素瘤(B16细胞)肿瘤模型,通过后续的纯化各种白细胞人口小鼠前列腺组织的详细解剖。
可以修改该协议,根据肿瘤的大小和源(皮下,自发肿瘤,或原位肿瘤)。对于肿瘤较大,因此建议增加分离缓冲区,互助的缓冲区,清洗量。的细胞heartiness的可以依靠他们正在丰富TME。例如,在我们的经验,细胞分离,从自发的前列腺肿瘤需要温和比从皮下B16黑色素瘤细胞的分离。在肿瘤的解剖,消除尽可能多的脂肪,皮肤或其他杂物,可以防止有效的酶解。至关重要的是要完全消化肿瘤的群众,并获得单细胞悬液,以确保适当的抗体标记,以防止堵塞列。髓系细胞的分离,小牛血清建议在互委会的隔离缓冲量从2%提高到10%,提高细胞活力。这也就是ESSE。107以保持所有的缓冲区和细胞整个寒冷的协议,以防止非特异性抗体结合和列堵塞。总之,获得高度富集的抗原提呈细胞和肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的人口,我们修改和优化利用天旎生物技术的抗体为基础的隔离程序。利用该协议,继转移和内源性白细胞人口可使用针对特定类型的细胞表面标志的ABS丰富。所描述的程序的一个好处是减少肿瘤的碎片进行了广泛和严格的洗涤。这包括胶原酶中使用的洗涤缓冲液,以及确定一个点,其中增加的压力,可以消除肿瘤细胞的列列木屐。获得足够数量的免疫细胞从组织,尤其是在纯度,是适用于功能分析,可以是一项艰巨的任务。然而,在我们的经验,此处的协议产生的细胞数量最多,最大的纯度,与大多数的一致性。
The authors have nothing to disclose.
笔者想感谢审查的手稿和视频斯科特博士达勒姆。壁间的美国国立卫生研究院,国家癌症研究所的研究计划,这项工作是在部分支持。
Reagent | Company | Catalouge Number | Comments |
Collagenase I | Gibco | 17100-017 | Use when selecting for T cells |
Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Use for myeloid selection |
DNase | Calbiochem | 260913 | |
RPMI | Gibco | 21870 | |
Dulbecco’s PBS | Lonza | 17-5158 | |
Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-501F | |
MACs Buffer | 2% FBS for T cells 10% FBS for myeloid cells |
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Thy1.1 PE | ebioscience | 551401 | |
Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 120-000-294 | |
Anti-Pan DC microbeads | Miltenyi Biotech | 120-003-183 | |
Anti-CD11b microbeads | Miltenyi Biotech | 120-000-300 | |
LC column | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | |
MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 |