عزل الخلايا المناعية من الأورام الأولية
Summary
في هذا التقرير، ونحن تصف بروتوكول لعزل السكان عالي النقاء من الكريات البيض التي تتسلل الأورام. ويتم تكييف هذا البروتوكول من بروتوكول للتكنولوجيا الحيوية لتعزيز الغلة Miltenyi والنقاء لعزل الخلايا من أنسجة الورم المعقدة.
Abstract
الأورام المكروية إنشاء مناعة فريدة من نوعها (المكروية الورم، TME) حيث يتم تجنيد الكريات البيض داخل الورم بواسطة كيموكينات المختلفة والنمو 1،2 العوامل. ومع ذلك، مرة واحدة في TME، هذه الخلايا تفقد القدرة على تعزيز مناعة المضادة للورم والبدء في دعم نمو الورم وأسفل تنظيم المضادة للورم الاستجابات المناعية 3-4. وقد ركزت الدراسات على الورم المرتبطة أساسا على الكريات البيضاء خلايا معزولة عن ورم الغدد الليمفاوية أو استنزاف الطحال بسبب الصعوبات الكامنة في الحصول على ما يكفي من أعداد الخلايا والنقاء من الورم الرئيسي. مع تحديد آليات تنشيط الخلايا والاتجار من خلال الجهاز الليمفاوي من الفئران الحاملة الورم المهم، وربما تعطي نظرة إلى حركية الاستجابات المناعية للسرطان، في تجربتنا، الكريات البيض عديدة، بما في ذلك الخلايا الجذعية (DCS)، ورم في استنزاف الغدد الليمفاوية يكون النمط الظاهري مختلفة عن تلك التي تتسلل الأورام 5،6. وعلاوة على ذلك، لقد أثبتنا سابقا أن adoptively-T نقل خلايا معزولة عن ورم الغدد الليمفاوية استنزاف لا tolerized وتكون قادرة على الاستجابة لتحفيز الثانوية في المختبر على عكس خلايا T معزولة عن TME، والتي هي tolerized وغير قادرة على الانتشار أو خلوى إنتاج 7،8. ومن المثير للاهتمام، وقد أظهرنا أن تغيير المكروية الورم، مثل توفير CD4 + T الخلايا المساعدة عن طريق نقل بالتبني، ويعزز CD8 + T للحفاظ على الخلايا الموالية للالتهابات وظائف المستجيب 5. النتائج من كل دراسة من الدراسات التي سبق ذكرها تدل على أهمية قياس الاستجابات الخلوية من خلايا المناعة TME-التسلل بدلا من الخلايا التي تبقى في الهامش. لدراسة وظيفة الخلايا المناعية التي تسلل الأورام باستخدام التكنولوجيا الحيوية العزلة Miltenyi نظام 9، وقمنا بتعديل هذا الإجراء الأمثل العزلة الأجسام المضادة المستندة إلى غاية الحصول على البريدnriched السكان من الخلايا السرطانية مستضد تقديم المستضد والخلايا الليمفاوية T محددة السامة للخلايا. بروتوكول يتضمن تشريح مفصل للأنسجة البروستاتا الفئران من نموذج البروستاتا الورم عفوية (غدية المعدلة وراثيا للماوس البروستات TRAMP) 10 وتحت الجلد القتامي (B16) نموذج الورم تليها تنقية لاحقة من السكان الكريات البيض المختلفة.
Protocol
Discussion
يمكن تعديل هذا البروتوكول، على أساس حجم ومصدر للورم (تحت الجلد، ورم عفوية، أو الأورام مثلي). للحصول على أكبر الأورام، فمن المستحسن أن زيادة كمية العازلة التفكك، عازلة أجهزة ماكينتوش، وعدد من يغسل. يمكن للالود للخلايا معزولة تعتمد على TME التي يجري المخصب فيها. على سبيل المثال، في تجربتنا، وخلايا معزولة عن أورام البروستاتا عفوية تتطلب ألطف تفارق من الخلايا المعزولة من الأورام تحت الجلد القتامي B16. خلال تشريح الورم، والقضاء على الكثير كما الدهنية، والجلد، أو غيرها من الحطام التي يمكن أن تمنع تفكك الأنزيمية فعالة. فمن الأهمية بمكان لهضم تماما الورم الجماهير والحصول على تعليق خلية واحدة لضمان حسن أب وضع العلامات ومنع أعمدة من انسداد. لعزل الخلايا النخاعي، تمت زيادة كمية المصل البقري الجنين الموصى بها في المخزن المؤقت بالاعمال العزلة من 2٪ إلى 10٪ لتحسين بقاء الخلية. بل هو أيضا ESSEntial للحفاظ على جميع مخازن والخلايا الباردة في جميع أنحاء بروتوكول لمنع غير محددة ملزمة أب وانسداد العمود. في الختام، للحصول على السكان عالي التخصيب من الخلايا مستضد تقديم المستضد وورم الخلايا الليمفاوية T محددة السامة للخلايا، وقمنا بتعديل الأمثل إجراء العزلة الأجسام المضادة القائمة على الاستفادة من التكنولوجيا الحيوية Miltenyi. استخدام هذا البروتوكول، يمكن نقل السكان على حد سواء المخصب adoptively والكريات البيض الذاتية باستخدام القيمة المطلقة الموجهة ضد علامات سطح الخلية نوع على حدة. ميزة واحدة من الإجراءات المذكورة هو الحد من الحطام الورم المرحل بعد غسل واسعة وصارمة. وهذا يشمل استخدام كولاجيناز في المخزن المؤقت غسل وكذلك تحديد النقطة التي واضاف الضغط على العمود يمكن القضاء على قباقيب عمود من الخلايا السرطانية. يمكن الحصول على عدد كاف من الخلايا المناعية الأنسجة من، وخاصة في نقاء التي هي مناسبة لتحليل وظيفي، يمكن أن يكون مهمة صعبة.ومع ذلك، في تجربتنا، وبروتوكول ينتج هنا أكبر عدد من الخلايا، في أكبر النقاء، مع معظم الاتساق.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور سكوت دورهام لإعادة النظر في مخطوطة والفيديو. ويدعم هذا العمل في جزء من برنامج البحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، NCI.
Materials
| Reagent | Company | Catalouge Number | Comments |
| Collagenase I | Gibco | 17100-017 | Use when selecting for T cells |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Use for myeloid selection |
| DNase | Calbiochem | 260913 | |
| RPMI | Gibco | 21870 | |
| Dulbecco’s PBS | Lonza | 17-5158 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-501F | |
| MACs Buffer | 2% FBS for T cells 10% FBS for myeloid cells |
||
| Thy1.1 PE | ebioscience | 551401 | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 120-000-294 | |
| Anti-Pan DC microbeads | Miltenyi Biotech | 120-003-183 | |
| Anti-CD11b microbeads | Miltenyi Biotech | 120-000-300 | |
| LC column | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 |
Referencias
- Shurin, M. R. Intratumoral cytokines/chemokines/growth factors and tumor infiltrating dendritic cells: friends or enemies. Cancer Metastasis Rev. 25, 333-356 (2006).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res. 66, 605-612 (2006).
- Anderson, M. J., Shafer-Weaver, K., Greenberg, N. M., Hurwitz, A. A. Tolerization of tumor-specific T cells despite efficient initial priming in a primary murine model of prostate cancer. J. Immunol. 178, 1268-1276 (2007).
- Ganss, R., Hanahan, D. Tumor microenvironment can restrict the effectiveness of activated antitumor lymphocytes. Cancer Res. 58, 4673-4681 (1998).
- Shafer-Weaver, K. A. Immunity to murine prostatic tumors: continuous provision of T-cell help prevents CD8 T-cell tolerance and activates tumor-infiltrating dendritic cells. Investigación sobre el cáncer. 69, 6256-6264 (2009).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Riboldi, E., Shafer-Weaver, K. A., Stagliano, K. E. R., Sklavos, M. M., Ambs, S., Yagita, H., Hurwitz, A. A. Foxo3a programs tumor associated dendritic cells to become tolerogenic in Human and Murine Prostate Cancer. Journal of Clinical Investigation. 121, (2011).
- Shafer-Weaver, K. A., Hurwitz, A. A. Tumor-Specific CD8+ T Cells Infiltrating Prostatic Tumors are Induced to Become Suppressor Cells. , (2009).
- Singh, V., Ji, Q., Feigenbaum, L., Leighty, R. M., Hurwitz, A. A. Melanoma progression despite infiltration by in vivo-primed TRP-2-specific T cells. J. Immunother. 32, 129-139 (2009).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).
- Hurwitz, A. A., Foster, B. A., Allison, J. P., Greenberg, N. M., Kwon, E. D. The TRAMP mouse as a model for prostate cancer. Curr. Protoc. Immunol. Chapter 20, (2001).
