Primer Tümörler gelen Bağışıklık Hücre İzolasyonu

1. Tramp Prostat Tümörler gelen Miyeloid Hücre İzolasyonu Tüm işlemler bir hayvan inceleme kurulu gözetiminde yapıldı. Tramp farelere kendiliğinden probasin promotör 10 tarafından kontrol edilen bir transgen (SV40) bir sonucu olarak otokton prostat tümörleri geliştirmektir. Herhangi bir erkek fare bu işlem için kullanılabilir. Tramp tümörleri her yaşta hasat edilebilir iken, fareler 20 haftadan daha büyük yaş gelene kadar Tramp prostat tümörleri genellikle küçük kaldığı unutulmamalıdır. CO 2 boğularak fareler Euthanize. Periton boşluğuna açık kesme ve adipoz doku geri çekerek, ürogenital sistem (UGT) çıkarın. Yağ dokusu köpüklü, parlak görünümlü bir dokudur. Mesane bulun; bu iki büyük, beyaz seminal veziküller arasında doğrudan yatıyor. Forseps ile mesane üzerine tutun. Tutulması makas adipoz doku kurtulmak ve üretra bulun kapattı. U azaltınmümkün olduğunca pelvis yakın olarak rethra ve vaz deferens sever. Düşürürken, aynı zamanda mesane yukarı çekin. Bu şimdi prostat lobları her birini elde etmek mikro-diseke olabilir tüm UGT yayınlayacak. Oda sıcaklığında PBS içinde UGT yerleştirin. UGT görselleştirmek ve herhangi bir aşırı yağ dokusu temizlemek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Forseps kullanarak, üretra üzerine tutun ve prostat, ventral lateral ve anterior loblar toplamak. Eğer lobların kalanı toplamak ise PBS doku yerleştirin. Seminal veziküller çıkartıp atın. Kalan doku 180 ° çevirin. Ampuller bezi ve dorsal prostat loblar toplayın. Forseps kullanarak, prostat dokusu dışında tease ve sindirim (ayrılma) tampon içine yerleştirin. 1 ml ayrışma tamponu (100 U / ml tip IV kollajenaz ve RPMI +% 10 FBS, 100 ug / ml DNase) içinde yer tümör dokusu. Her tümör mayıs require benzersiz ayrışma koşulları; Tramp prostat tümörleri için, 1 ml kullanmak ve B16 tümörler için, (bkz aşağıda) 5 ml kullanın. Not: Kollajenaz (I-IV) notu izole olarak hücre popülasyonunu bağlıdır; lenfosit verim tip I kullanarak daha yüksek iken, miyeloid hücre izolasyonu, tip IV ile en iyisidir 37 içinde yer tüpü 30 dakika süreyle ° C inkübatöründe. Kolayca akan tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 1 ml pipet ile yukarı ve aşağı Pipeti. Filtre 70 mikron filtre ile süspansiyon ve miyeloid hücre izolasyonu için% 10 FBS ile takviye MACs ayırma tamponu ile 3x yıkayın. 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje hücre süspansiyonu. Daha sonra 10 ml MACs tamponu ile pelet durulayın ve aynı ayarlarla tekrar santrifüj. 100 ul MACs tampon içinde hücre pelletini. Daha sonra, 10 8 hücreleri (200 ul kültür yüzey 2.4.G2 hibridoma) başına 1 ug anti-CD16/32 antikoru (Ab) ekleyin ve 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. Not: tO eklenecek FCR-γ engelleme antikoru (Ab) miktarı dokuda frekans / sayısı FCR-γ + hücreleri ve hücre süspansiyonu hacmi bağlı olarak değişebilir ve bu nedenle, bu adım optimizasyon gerektirebilir. "Pan-DC" 100 ul veya anti-CD11b, anti-CD11c veya anti-PUKÖ-1 istenen hücre popülasyonuna bağlı 10 8 toplam hücre başına mikroküreler. 10 ul ekle Not: gerekli mikroboncuk miktarı dokuda istenen nüfusun hücrelerinin frekans / sayısına bağlı olarak değişebilir ve bu nedenle, bu adım optimizasyon gerektirebilir. Yavaşça tüp (Vortex Etmeyin) hafifçe vurarak İyice karıştırın ve ışıktan korumalı 4-8 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Buz üzerinde inkübe etmeyin. MAC tampon 10 ml eklenerek hücrelerin yıkanır. 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje. Tamamen Süpernatant kapalı dökün ve MAC tampon 500 ul hücreleri tekrar süspansiyon. Tümör hücre süspansiyonları LC sütunlar aracılığıyla daha iyi akar. (Diğerseçimler: MS, LS, LD). Mıknatıslı ayırıcı taze bir sütun uygulayın. Başbakan seçilen sütun için MACs tamponu uygun bir miktarı ile durulama sütun: LC ve MS sütunlar için 500 ul kullanın. LS veya LD için kolon 1 ml kullanın. Astar sütunu sonra, sütun üstüne hücre süspansiyonu uygulanır. Her 1 x 10 8 hücre için bir sütun kullanın. Etiketsiz hücreleri (pass-through) toplayın ve sıvı yıkama 1.5-2.5 ml olmak üzere toplam 500 ul hacmine sahip sütun üç (beş) kez en az yıkayın. Sütuna MACs tampon ekleyerek adım 1 yıkayın gerçekleştirir; bu sütun akan tutmak için önemlidir. En kısa sürede sütun son damla damlar gibi, daha fazla tampon ekleyin. Akışı olmadan sütun bekletin ya da (bu saflık mahvetmesine ve hücre canlılığı önemli kaybına yol açabilir sütun kurutma gibi, hafife alınamaz.) Kuru çalışmasına izin vermeyin. Yıkama 2. adım için (de olarak Kollajenaz + DNaz içeren ayrışma tampon karışımı ile sütun durulayınAdım 1.7) 'de tarif edildiği, bu ölü veya ölmekte tümör hücrelerinin yapışkan kalıntıları temizlemek için bir "sert" yıkama adımı olarak hizmet vermektedir. MACs tamponu ile 3. adımı uygulayın yıkayın; aracılığıyla akışı yıkama 3. adım sonra tamamen net görünmüyor ise, MAC tampon (5 yıkama toplam) ile 2 ilave yıkama adımlar için yıkamaya devam ediyor. Büyük subkutan tümörler için (örneğin, B16 melanom), son yıkama adımı sırasında, sütunun üstüne bir eldivenli parmak ucu ile hafif basınç uygulanır; bu hücre popülasyonu saf, temiz bir ekstra enkaz bırakır. Bu adım gibi prostat gibi katı doku tümörleri için gerekli değildir, bunun yerine, en az 5-6 kez toplam yıkama, ekstra yıkama adımları kullanın. Manyetik ayırıcı ile sütun çıkarın ve uygun bir toplama tüpü üzerine yerleştirin. Sütun üzerine tampon pipetle 2 ml. Sıkıca sütunu ile birlikte piston uygulayarak manyetik etiketli hücreleri toplayın. Tarafından hücre sayısını sayar ve seçilen hücre nüfus için saflık onaylamaksitometride akar. DC popülasyonun belirlenmesi için önerilen işaretleri B220 ve CD11b CD45, CD11c, PUKÖ-1 içerir. Önerilen makrofaj belirteçler CD45, CD11b, F4-80 ve Ly6C içerir. 2. Subkutan B16 Melanom Tümörler gelen Adoptively Aktarılan T hücrelerinin izolasyonu Bu protokol, 250 mm 2 veya (tümörün iki eşit parçaya böler çapları ölçülerek tahmin) daha az olan tümörler en iyi şekilde çalışır. B16 tümör hücreleri C57BL içine deri altından enjekte edilmiştir / 6 fare ve tümör ölçümü 2 günde 8 kaydedildi. 250 mm 2 ölçüm tümörlü farelerin CO 2 boğularak ötenazi edilir. % 70 EtOH ile yıkanır otoklav cerrahi araçlar kullanılarak, küçük (<3 mm) parçalar halinde kesilmiş ve tümör 5 ml ayrışma çözeltisi (RPMI medyumu% 5 FBS, tip I Kollajenaz (200 U / ml) ve Dnaz i (100 ug ile desteklenmiş içinde kuluçkaya 37, 30 dakika ° C için, / ml)) (a 1000 μ kullanılarak Pipetlemel pipet ucu) ve inkübasyon sırasında her 10 dakikada bir karıştırın. Miyeloid hücreleri daha sonra izole edilir ise, FBS ve Kollajenaz% 10 FBS ve sırasıyla tip IV kollajenaz (200 U / ml), tip I ile% 5 ikame. Inkübasyondan sonra, 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçmesi ve 10 ml MACs tampon (üreticinin talimatlarına, Miltenyi Biotech göre hazırlanmış) ile iki kez yıkayın. İsteğe bağlı – çok büyük tümörler için (> 300 mm 2), inflamatuar hücreler yoğunluk gradiyenti santrifüj (Percoll veya Ficoll) kullanılarak önceden zenginleştirilmiş olabilir. Yıkama süpernatan aspire ve 1 ug anti-CD16/32 antibody/10 8 hücreleri (klon 2.4.G2 kültür yüzey 200 ul) ekleyin ve 10 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. Yıkama olmadan, yavaşça ışıktan korumalı buz üzerinde 30 dakika için tüp ve inkübe hafifçe vurarak iyice karıştırın, 10 8 hücre başına 1 mikrogram anti-Thy1.1 PE antikor ekleyin. Ilişkisiz pri kaldırmak için hücreleri yıkayın5 dakika boyunca 400 x g'de 10 ml tampon MAC ve santrifüj ilave edilerek primer antikor. Süpernatant aspire ve üretici talimatlarına göre, 10 7 toplam hücre başına 20 ul anti-PE mikro (Miltenyi Biotech) ekleyin. Yavaşça tüp (vorteks istemiyorum) hafifçe vurarak İyice karıştırılır ve 4 ° C'de inkübe ışıktan korumalı 15 dakika, için (buz kullanmayın). Dikkat: vorteks boncuklar bütünlüğü azaltabilir. 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj MACs tampon ve 10 ml eklenerek hücrelerin yıkanır. 500 ul MACs tampon süpernatan ve Pastör pipetiyle hücreleri aspire. Daha büyük boyutta (> 300 mm 2) arasında olan tümörlerde, 1 ml tampon kullanabilir. Manyetik alan ayracı koyun bir LC (Büyük Hücreli) sütun. Tümör hücre süspansiyonları bu sütunlar aracılığıyla iyi akar. Sütun asal üzere 500 ul MACs tamponu ile sütun çalkalayın. Çoğu tümörler de LS ve LD sütunlar dolaşmasını, ancak daha fazla sindirim ve mekanik d gerektirecektirtek hücre süspansiyonu uygun seviyeye ulaşmak için isruption. Sütun asal 1 ml MACs tamponu ile sütun yıkanır. Sütun üzerine hücre süspansiyonu uygulayın ve (sütun vadede kuru izin vermeden) tamamen dolaşmasını sağlar. Sonraki, 500 ul MACs tamponu ile yıkayın ve 3x yıkama tekrarlayın. Sadece kolon rezervuar boş olduğunda yeni tampon ekleyebilirsiniz, ancak sütun akışı olmadan ayakta izin vermeyin. Bu tıkanması ve azalan saflık neden olacaktır. Bu büyük subkutan tümörler için kritik bir adımdır: son yıkama adımından sonra, eldivenli parmak ucu ile, manyetik ayırıcı devam ederken sütunun üst hafifçe basınç uygulayın. Bu, daha saf zenginleştirilmiş nüfus için fazladan enkaz bırakır. Sonraki, 500 ul MACs tamponu ile kolon 1 kez daha yıkayın. Ayırıcısından sütun çıkarın ve temiz bir 15 ml konik tüp yerleştirmek, sütun üzerine 2 ml MACs tamponu ekleyin. Manyetik etiketli cel dışarı floşsıkıca sütuna pistonu iterek ls. 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje Elüsyonlanan fraksiyonu. Bu aşamada Saflık genellikle% 75-80 arasındadır. >% 90 saflıkta elde etmek için, yeni bir şekilde MS kolonu kullanılarak adım 1,10-1,12 tarif manyetik ayırma işlemi tekrar edin. MS sütun süspansiyon sütun üzerinden daha yavaş çalışacak şekilde daha küçük ve daha kompakt, ancak yüksek numaraları ve ilgi hücre saflık verecektir. Daha sonraki denemeler için hücre sayısını sayar ve flow sitometri ile saflık kontrol edin. Bu tür Bu protokolde tarif edilenler gibi adoptively transfer T hücrelerinin izolasyonu için, kimlik tesbiti için alel belirteçler CD45 ve Thy1.1 (transfer hücreleri) ve Thy1.2 (host T hücreleri) içerir. 3. Temsilcisi Sonuçlar Belirli bir hücre nüfusu (yani makrofajlar, DC, T-hücresi, vb) arasında verim tümör büyüklüğü ve yönetici edildi tedaviler bağlı olarak değişecektirtümör büyümesi sırasında silinmiştir. Işlenmemiş bir 14-16 haftalık Tramp fare A prostat 5-1×10 6 CD11c + / PUKÖ-1% 90-95 saflıkta veya 1×10 6-1.5×10 6 F4/80 az + (DC) hücreleri + / CD11b 8×10 arasında vermelidir + (makrofajlar) doku 300 mg% 80-90 saflıkta olarak Şekil 1'de gösterildiği gibi, yukarıdaki izolasyon protokolü takip. Bu hücrelerin sayısı, her biri biraz tümör-antijen spesifik T hücre adoptif transferi üzerine arttırır. Zayıf saflık (sütununda tümör kalıntı retansiyon yol açabilir ki) sütunu kurutmak için izin veren, genellikle yetersiz yıkama bir sonucu olan, ya da yetersiz Fc reseptör engelleme. Benzer şekilde, B16 tümörler izole edilen toplam hücreleri de doku hasat zamanı ve DC aşı olan veya olmayan T hücreleri (5×10 6 transferi) (1×10 5 transfer) evlatlık transfer tümörün büyüklüğüne bağlı olarak değişir. Çok az antijen-SPEantijen-darbeli DC aşısı da T hücre transferinden sonra bir gün verilmedikçe cific T hücrelerinin tümör sızmak. Bir DC aşı küçük bir somut, (<50 mm 2) tümörü taşıyan bir fare,% 80-85 bir saflığa sahip yaklaşık 3×10 5 Thy1.1 + T hücreleri, bir verim tatbik edilirse, bir "iyi düşünülebilir "olarak Şekil 2a'da gösterilen hasat. Daha büyük tümörler hasat edilmiştir, ancak, toplam verim ve saflıkta azalacaktır. Makrofajlar (F4/80 + / CD11b +) genellikle B16 tümörlerde toplam hücre daha küçük bir yüzdesi vardır. Şekil 2B, bir tümör, CD11b kullanan bir 250 mm 2 olduğunu gösterir% 90-95 saflıkta yaklaşık 1×10 6 makrofajlar verimleri . B16 tümörlerde DC nüfusun heterojen olduğu Ayrıca, Şekil 2B gösterir. Prostat tümörlerinde, iki subpopülasyonunun aksine: CD11c + / PUKÖ-1 + (plazmasitoid DC) ve CD11c+ / PDCA-1 – (konvansiyonel DC) B16 melanoma tümörler elde edilebilir. Tahminen 2×10 6 PDC ve 4×10 6 CDC% 80-90 saflıkta az 250 mm 2 B16 tümörlerden bekleniyor. İndirgenmiş saflığı genellikle sütunundan tümörler hücreleri temizleme olmayan bir sonucudur. Adım 2.12 kolonunun tabanındaki devam melanoma hücrelerinde küçük yığın kaldırmak için kritik bir adımdır. Bu aşamadan sonra daha iyi bir saflıkta yıkama adımları ve sonuç etkinliğini arttırır. Şekil 1. DC'ler (CD11c + / PUKÖ-1 +) ve makrofajlar (F4/80 + / CD11b +) bir serseri prostat tümörü izole edilmiştir. Nokta plot değerleri ilgi öncesi veya sonrasında saflaştırılması hücrelerin yüzdesi temsil eder. Şekil 2,. (A) Adoptively Thy1.1 + / CD8 + T hücreleri transfer ve (B) CD11c + / PUKÖ-1 dahil Myeloid hücreleri + plasmasitoid DC'ler, CD11c + / PUKÖ-1 – konvansiyonel DC'ler ve F4/80 + / CD11b + makrofajlar subkutan izole edildi Thy1.2 + farelerin B16 melanoma tümör. Nokta plot değerleri ilgi öncesi veya sonrasında saflaştırılması hücrelerin yüzdesi temsil eder.