分離して骨格筋に発現し、最も豊富なタンパク質の同一性を決定するための方法の直接的なセット。約800スポットが10 mgの筋から二次元ゲル上に明察しているが、これは性別特異的タンパク質の発現の判定が可能になります。これらのメソッドは、ほとんどの組織で同等の結果が得られます。
骨格筋の総収縮は、主に収縮タンパク質の比較的小さな数によって決定されますが、この組織はまた、廃用による抵抗運動と萎縮によって肥大などの環境要因1〜非常に適応可能です。それは、それによってストレッサー(熱、虚血、重金属、 など 。)2,3に改造し、適応を示す。 、いわゆる伸張性収縮の4を長くしながら、ダメージは筋力発揮する力が筋肉に発生する可能性があります。収縮タンパク質は、そのようなexertionsに損傷や劣化及び/または再合成、修復する必要があることができ、これらの関数は、収縮タンパク質の一部ではないが、セル内の他のはるかに少ない種類のタンパク質で構成。差を決定するタンパク質のサブセットが損傷のこのタイプの改善に関与しているかを判断するには、グローバルなプロテオームは5を行使する前に確立されている必要がありますし、練習に続いて続いてタンパク質の発現と、それによって損傷とその修復の適応での候補タンパク質を強調表示します。さらに、骨格筋のほとんどの研究は、種のオスで実施されており、それ故に女性の筋肉の代表的な場合があります。
この記事では、男性と女性の筋肉から、再現性のタンパク質を抽出し、高解像度デジタル画像6で続いて二次元ゲル電気泳動によって、それらを分離する手法を提案する。これは統計的に有意(p <0.05)に2倍の増加または減少、コントロールの状態から、表示または非表示。示しスポット(およびその後のタンパク質を同定)するためのプロトコルを提供します。これらはその後、摘出トリプシンで消化し 、タンパク質同定のための質量分析計(LC / MS)(LC / MS / MS)5に結合し、高圧液体クロマトグラフィーによって分離されています。この方法論(図1)(肝臓、脳、耳のない変更がほとんどで、多くの組織で使用することができますトンなど 。)。
ここで紹介するLC / MSプロテオミクスの方法は、骨格筋のプロテオームの最初のレベルを迅速に解析するための最も信頼性と再現性のプロトコルです。それは、ジェンダーの特異性の合理的便宜を比較することができます。低濃度のタンパク質は、筋肉のサンプルの分画は、それによって低濃度のタンパク質を増加させる、可能な限り収縮タンパク質のような多くを除去するために必要になります。必要に応じて、プロテオームプロフィールを自分好みに仕立てる異なるpH範囲のIPGストリップと代替割合の勾配ゲルで行うことができます。より多くの感受性蛍光染色は存在するが、我々は、各研究室では、システム内のこれらの汚れの直線性を決定することをお勧めします。タンパク質発現のより厳密な分析のためDIGEシステム(二次元電気泳動システム – ゲル法では、GEヘルスケアバイオサイエンス)を使用することができるが、しかし、これは方法論に複雑さのレベルを追加しません。さらに、ここに記述されたプロトコルは、ほとんどのANIを使用することができます重複する酵素断片がほかに高純度の酵素を使用して生成することができるので、ゲノムが同様に任意のソースからの蛋白質のde novoシーケンスとして、配列されている熱の組織は、限りそれは、二次元ゲル上で分離することができますトリプシンに。膜と疎水性タンパク質を探して、しかし、我々は心臓、肝臓、腎臓および脳組織では、このプロトコルを使用して良い結果を持っている場合は特に、他の組織源からのサンプルは、抽出の方法論におけるいくつかの変化が必要になる場合があります。他の翻訳後修飾は、マススペクトルデータベースの検索条件を変更することによって検出することができる。要するに、我々はプロテオームプロファイリング解析のための合理的に詳細な初期プロトコルを提示している。
The authors have nothing to disclose.
我々は図3の使用のためYutianガンに感謝。スミスカレッジブレークスリー、Wilensとホームズの資金;、ハワードヒューズ医学研究所は、この作品は、全米科学財団0420971によってサポートされていました。
Name of the reagent | Tipo | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|---|
PepClean C-18 Spin Columns |
Consumable | ThermoFisher Scientific |
PI-89870 | |
Pepswift monolithic column (100um x 5 cm) |
Consumable | Dionex | 162348 | |
Criterion pre-cast 10.5%-14% Tris-HCl SDS polyacrylamide gels |
Consumable | BioRad | 345-0106 | |
Readystrip IPG strips | Consumable | BioRad | Varying pH ranges |
|
Acetic acid | Reagent | Fisher Scientific | A465-1 | |
Acetone | Reagent | Pharmco | 329000 | |
Acetonitrile | Reagent | Fisher Scientific | A955 | |
Agarose | Reagent | BioRad | 163-2111 | Overlay solution |
Ammonium bicarbonate | Reagent | Fluka | 40867 | |
Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | BP114 | |
Bio-Lyte Ampholytes | Reagent | BioRad | Varying pH ranges |
|
CHAPS | Reagent | USB | 13361 | |
Commassie blue R-250 | Reagent | ThermoFisher Scientific |
20278 | |
Dithiothreitol (DTT) | Reagent | USB | 15395 | |
Formic acid | Reagent | ThermoFisher Scientific |
28905 | |
Glycerol | Reagent | Sigma-Aldrich | G6279 | |
Glycine | Reagent | USB | 16407 | |
Iodoacetamide | Reagent | Sigma-Aldrich | I6125 | |
Methanol | Reagent | Fisher Scientific | A452 | |
Mineral oil | Reagent | BioRad | 163-2129 | |
Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | L6026 | |
Tris base | Reagent | Sigma-Aldrich | 93349 | |
Tris[2-carboexyethyl] phosphine |
Reagent | ThermoFisher Scientific |
77720 | |
Trypsin Endoproteinase, TPCK treated, MS grade |
Reagent | Pierce | 90055 | modified |
Urea | Reagent | USB | 75826 | |
Water | Reagent | Burdick& Jackson |
365 | |
Centrivap Concentrator | Tool | Labconco | ||
Exquest spot cutter | Tool | BioRad | ||
LCQ Deca XP Max ion trap mass spectrometer |
Tool | ThermoFisher Scientific |
||
Motorized pestle | Tool | Kontes Corp | ||
Polypropylene stirring | Tool | BioSpec Prod | ||
rods | ||||
PROTEAN IEF cell | Tool | BioRad | ||
Sonicator | Tool | Branson | ||
Surveyor Plus HPLC system |
Tool | ThermoFisher Scientific |
||
VersaDoc imaging system |
Tool | BioRad |