骨骼肌蛋白质组学性别异形

1。样品制备从小鼠为起始原料，使用新鲜，闪光灯，冻结或RNAlater处理的组织。离开前出发Kimwipe吸干多余的防腐剂。 删除所有周围肌肉的肌腱和筋膜，并直言不讳地在寒冷的房间（4℃）2分钟冷却玻璃板与单刃剃须刀刀片的组织，直到该组织是切碎或粉状。在预先称重的离心管收集样品，并确定组织的重量。使用为您的起始原料组织不超过10毫克。 添加45μL，每1毫克剁碎组织提取缓冲液（8 M尿素，50毫米数码地面电视，4％CHAPS，0.2％的载体两性电解质5 / 8，0.0002％溴酚蓝），在常温下。如果体积大于350μL，加350μL的最初和同质化（步骤1.4），再加入其余缓冲区，以尽量减少飞溅。 均质的组织为15秒，7次机动杵（Kontes公司）4℃，彼此之间的同质化冰的冷却两分钟。 离心30分钟，在15600 XG样品在4 ° C。保存上清液并测量其体积。细胞碎片颗粒被丢弃。 上清液中的蛋白质沉淀用冰冷的试剂级丙酮（3倍V：V比）。涡管15秒。离心15600为10秒XG形成的颗粒，并在提取缓冲液重悬与Kontes电机和聚丙烯搅拌棒（BioSpec产品） 重复步骤1.6。 无论是进行蛋白质样品的浓度估计或存放于-20 ° C 2。蛋白质浓度估计使用洛瑞检测7或BCA法测定8（皮尔斯）;约4.5毫克毫升-1的目的。 3。等电聚焦删除一个ReadyStrip IPG胶条（11厘米，pH值5-8，Bio – Rad公司）从-20 ° C，并允许它在室温下平衡10-15分钟。 涡样品和吸管600-800微克的蛋白质样品（总体积200μL），一个在一个样品中的补液托盘通道的后缘的直线，留在每年年底的约1厘米。 使用钳，剥离IPG胶条的塑料盖 – 确保只能处理地带的两端，避免任何与凝胶接触。注意的地带基本结束，并在左侧的托盘位置。将样品的顶部下来的IPG胶条胶边，避免诱捕气泡下方。允许它为一小时，以补充水分。 覆盖与2.5毫升矿物油（BioRad公司）。盖盖子的托盘，并留下在室温下过夜补充水分。 重点托盘通道两端放置在一纸灯芯，和每一个10μL的微孔水浸湿。 取出IPG胶条，并保持垂直约10秒钟，沥干油。印迹胶Backing与一个Kimwipe。 将下来，基本结束左聚焦托盘的IPG胶条胶边。盖2.5毫升矿物油的地带。 放入托盘PROTEAN IEF细胞（BIO – RAD）和计划3个步骤协议（见表1）在默认情况下电池温度20℃，最大电流为50μA/条，并没有补液时间。 电压时间伏特小时舷梯第1步 250 20分钟线性第2步 8000 2.5小时线性第3步 8000 40000 快速共有 6.5小时 40000 表1。三步协议PROTEAN IEF细胞IPG胶条为11厘米。 以基金的使用钳细胞IPG胶条。吸干与Kimwipe的塑料支持，并放置在一个干净的补液托盘IPG胶条胶侧。可以覆盖补液托盘和包装用保鲜膜，并存储在 – 80 ° C或进行。 4。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转移到一个11厘米的平衡托盘的条状（凝胶的一面朝上）。 添加4毫升减少缓冲区（6 M尿素，2％SDS，0.05 M的Tris / HCl进行pH值8.8，20％甘油，2％的数码地面电视）的渠道和平衡轻微摇晃10分钟的地带。 卸下减少缓冲区，烷基化缓冲（6 M尿素，2％SDS，0.05 M的Tris / HCl进行pH值8.8，20％甘油，2.5％碘乙酰胺）添加4毫升和平衡轻微摇晃10分钟的地带。 冲洗浸泡STRI IPG胶条p简要1 × SDS电泳缓冲液（25毫米的Tris，甘氨酸192毫米，0.1％SDS，pH值8.2）。 条形凝胶的一面向上奠定到11厘米的背面板的标准预制10.5％-14％的Tris – HCl SDS聚丙烯酰胺凝胶（Bio – Rad公司），所以它轻轻推，它使得与SDS凝胶充分接触;确保被困两者之间的凝胶表面无气泡。 熔化的琼脂糖溶液1毫升（0.5％琼脂糖，25毫米三，192毫米甘氨酸，0.1％SDS，溴酚蓝）的IPG胶条覆盖，让琼脂糖固化5分钟。 负载5μL蛋白标记的10-225 kDa的（USB接口，P / N：76740）成分子量标准单井。 在室温下，在200 V或在寒冷的房间（4℃）使用溴酚蓝染料前端迁移到监控电泳凝胶在SDS缓冲液（25毫米的Tris，甘氨酸192毫米，0.1％SDS，pH值8.2）运行。 从塑料演员取出凝胶染色考马斯亮蓝轻轻摇晃过夜R – 250染色（甲醇45.5％，45.5％dH2O，9.0％醋酸，0.25％考马斯亮蓝R – 250）。 两次动摇Destain 1的溶液（9.0％乙酸甲醇45.5％，45.5％DH 2 O）的凝胶为3小时，每Destain 2（5％甲醇，90％DH 2 O 5％乙酸）过夜。存放在7％醋酸凝胶进行分析。 5。凝胶成像和分析捕捉图像的使用数量的一个软件程序，经营VersaDoc成像系统（BioRad公司）凝胶。作物在实验中所有的凝胶均匀的图像区域。 PDQuest 8.0软件程序装入裁剪图像来创建一个实验集。按照实验设置向导来定义整个凝胶的现场检测和现场匹配的参数。检查和完善现货，如果需要手动匹配的结果。 凝胶进行定量和统计分析，检测与TW匹配的蛋白质点O -倍或更高的统计学意义的差异表达，两者之间的凝胶组。创建与这些利益点分析，并削减他们使用EXQuest当场切割机（BioRad公司），胰蛋白酶消化的LC – MS为基础的蛋白质鉴定。 6。凝胶中的胰蛋白酶消化对于这一步修改后的皮尔斯 – 凝胶胰蛋白酶解包（＃89871X，皮尔斯）协议使用。 加入200μL的脱色液（25毫米碳铵，50％乙腈）凝胶插头。涡和样品在37 ° C时30分钟，用颤抖的。小心取出并丢弃的解决方案。 重复步骤6.1。 加入30μL新鲜配制的减少缓冲区（50毫米三[2 – 羧乙基]膦，碳铵22.5毫米）管含有凝胶的插头和孵育10分钟，在60 ° C。 允许样品冷却，然后取出并丢弃减少缓冲区。加入30μL烷基化缓冲区（100毫米碘乙酰胺，20毫米的碳酸氢铵，立即箔纸包裹的管使用前的准备。样品在室温下孵育1小时在黑暗中。 取下并丢弃的烷基化缓冲区。洗净，加入脱色的解决方案，以每管200μL凝胶插头。样品在37 ° C下15分钟。 取下并丢弃的脱色液，重复清洗。 加入50μL乙腈凝胶插头，并培育他们在室温下10分钟，让他们干收缩，然后小心地除去乙腈。 再次重复步骤6.8。凝胶块应该看看白电和小。 允许在Centrivap浓缩为10分钟（Labconco，型号EX1245）干凝胶件。 膨胀的凝胶块，加入10μL激活胰蛋白酶溶液（10毫微克/μL胰蛋白酶，碳铵25毫米）。在室温下孵育15米inutes。 添加25μL消化缓冲液（25毫米碳酸氢铵）管。在室温下用颤抖的隔夜孵育样品。 超声10分钟的样品（布兰森，浴sonicator模型2510）和自旋去除上清到一个新的管前。保存上清。 为了进一步提取的多肽，添加在室温下5分钟，用颤抖的10μL0.1％甲酸和孵化。超声10分钟的样品，收集上清，并结合步骤6.13上清保存在。 7。微尺度脱盐肽提取删除PepClean的C – 18离心柱（ThermoFisher）根据制造商的说明的帮助肽提取碳酸氢铵等无机盐。 两次与20μL，70％的乙腈洗脱肽，蒸发Centrivap浓缩离心干燥1小时和重悬样品在10μL的0.1％甲酸MS分析肽。 8。 HPLC耦合质谱的蛋白质鉴定单独的5μL肽混合物的高效液相色谱（HPLC）超过40分钟，用0.​​2％甲酸一个Pepswift单片的PS – DVB列（戴安）线性2-50％乙腈梯度耦合到纳流我源到一个离子阱质谱仪（LCQ DECA XP中最大，赛默飞世尔科技）在流量400 NL / min的提示。 检测400之间的肽MS1的信号 – 1400 m / z和允许3 MS2的测序CID动态排斥孤立的最激烈的离子峰。 对于蛋白质鉴定，分析通过烷基化半胱氨酸修改了静态和动态修改（丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸）磷酸化，甲基化的一个SEQUEST鼠标参考数据库检索（BioWorks软件，热尔科技）的肽结果TION（组氨酸），氧化（蛋氨酸）的ADP -核糖基化（精氨酸）和N -末端乙酰。应用保守的匹配标准（例如，设置为2阿拉伯马格里布联盟和1.00片段宽容，蛋白质中含有至少2肽传递Xcorr VS充电状态过滤器的肽宽容[Z = 1 / X = 1.5，Z = 2 / X = 2.00，Z = 3 / X = 2.50，Z = 4 / X = 3.00]和p的概率<0.05），5，手动检查信心蛋白质鉴定的质谱图。 9。代表性的成果： 男性和女性未行使的，小鼠骨骼肌（肱二头肌）提取和分离到一个二维地图5，第一层次的肌肉比较蛋白质组（图2）。一旦使用高分辨率数字成像可视化的，在每个检测到的约800个蛋白点。使用男性的蛋白质组图谱作为基准，很显然，有众多的景点，纷纷改变在女性的蛋白质组。当场强度措施中蛋白质金额的变化（图3）。变化超过2倍（向上或向下）的蛋白质点的身份统计学意义（P <0.05），与一个n = 5只，是由氨基酸序列，使用液相色谱耦合质谱分析。这些结果表明，女性表现出糖的能量代谢酶和肌酸激酶（CK）的异构体，肌肉在不同的能源供应系统的丰度减少。人类和动物显示较高的男性在休息和下面的练习9,10血清CK水平，但血清CK水平并不一定相关的肌原纤维破坏11,12量。这在CK的细胞丰度在小鼠肱二头肌的两性异形是一种新型的finding5可能回答的生理不同的血清CK水平。 数字： g1.jpg“/> 图1比较蛋白质组学的协议的一个整体示意图。该协议分为三组：样品制备，样品分析和蛋白质鉴定。这三组协议的两端也是合理的暂停的地方，尽管最好的结果是得到整体的协议是，如果不停止。 图2比较雌性小鼠肱二头肌蛋白点相对男性在肱二头肌的相同点（O绿色圆圈）。斑点，增加大于或等于女性的2倍盘旋红色（o）和下降小于或等于2倍盘旋蓝（O）。 图3凝胶点强度分析：X轴，女运动前（对照组，N = 5）; Y轴，女单一回合0小时时间点组（N = 5）。回归线：相关系数= 0.919;斜率= 0.976;拦截= -0.0293。以上的红线和蓝线以下的斑点变化超过+ / – 2倍。