Músculo Esquelético dimorfismo de género de Proteómica

1. Preparación de la muestra El uso de tejido fresco, congelado o en flash RNAlater tratos de los ratones como material de partida. Blot a la basura cualquier exceso con un conservante Kimwipe antes de proceder. Eliminar todos los tendones y la fascia alrededor del músculo y el tejido con pelos en las hojas de afeitar solo filo para los 2 minutos en placas de vidrio enfriado en un cuarto frío (4 ° C) hasta que el tejido está bien picado o en polvo. Recoger la muestra en un tubo de microcentrífuga previamente pesado y determinar el peso del tejido. No utilice más de 10 mg de tejido como material de partida. Añadir 45 l de tampón de extracción (8 M urea, 50 mM DTT, CHAPS 4%, 0,2% anfolitos transportista 5.8, 0,0002% bromofenol azul) por mg de tejido una picada, a temperatura ambiente. Si el volumen es superior a 350 l, 350 l añadir inicialmente y homogeneizar (paso 1.4), a continuación, añadir el resto del buffer para minimizar las salpicaduras. Homogeneizar el tejido siete veces con un mazo motorizado (Kontes Corp) durante 15 segundos a4 ° C, con dos minutos de enfriamiento en hielo entre cada homogenización. Centrifugar las muestras a 15.600 xg durante 30 minutos a 4 ° C. Guardar el sobrenadante y medir su volumen. Los restos de sedimento de células se descarta. Precipitar las proteínas en el sobrenadante con helado de acetona de grado reactivo (3 veces v: relación v). Vortex los tubos durante 15 segundos. Centrífuga para 15.600 xg durante 10 segundos para formar pellets y resuspender en tampón de extracción con el motor y barras de polipropileno Kontes agitación (BioSpec Prod) Repita el paso 1.6. O bien proceder a la estimación de concentración de proteínas de las muestras o almacenarlos a -20 ° C. 2. Proteína estimación de concentración Use el ensayo de Lowry 7 o el ensayo BCA 8 (Pierce), objetivo de unos 4,5 mg ml -1. 3. Isoelectroenfoque Quitar una tira IPG ReadyStrip (11 cm, pH 5.8, Bio-Rad)desde -20 ° C y deje que se equilibre a temperatura ambiente durante 10-15 min. Vortex la muestra y la pipeta 600-800 mg (volumen total 200 l) de la muestra de la proteína en una línea recta en el borde posterior de un canal en la bandeja de rehidratación de la muestra, dejando aproximadamente 1 cm en cada extremo. Con unas pinzas, retire la tapa de plástico de la tira IPG – Asegúrese de manejar sólo los extremos de la banda y evitar cualquier contacto con el gel. Nota final básicos de la tira y colocarla en el lado izquierdo de la bandeja. Coloque la tira IPG gel hacia abajo en la parte superior de la muestra, evite la retención de burbujas debajo. Deje que se rehidratan durante una hora. Superposición con 2,5 ml de aceite mineral (BioRad). Cubra la bandeja con la tapa, y dejar hidratar durante la noche a temperatura ambiente. Coloque una mecha de papel en ambos extremos del canal de la bandeja de enfoque y húmeda cada uno con 10 l de agua Millipore. Saque la tira IPG y sosténgalo de forma vertical durante unos 10 segundos el desagüe el aceite. Seque la b de plásticoACKing con un Kimwipe. Coloque el lado de la tira de gel IPG abajo y con fines básicos de la izquierda en la bandeja de enfoque. Cubrir la franja con 2,5 ml de aceite mineral. Coloque la bandeja en la célula PROTEAN IEF (Bio-Rad) y el programa de un protocolo de 3 pasos (Tabla 1) a la temperatura de celda predeterminado de 20 ° C, una corriente máxima de 50 mA / tira, y no hay tiempo de rehidratación. Voltaje Tiempo Volt-Horas Rampa Paso 1 250 20 min Lineal Paso 2 8000 2,5 horas Lineal Paso 3 8000 40.000 Rápido Total 6,5 horas 40.000 Tabla 1. Tres pasos del protocolo de Protean IEF celular de 11 cm IPG tiras. Tome las tiras IPG fuera de la célula del IEF con el fórceps. Seque el respaldo de plástico con un Kimwipe y coloque el lado tira de gel IPG en una bandeja de rehidratación limpia. Puede cubrir la bandeja de rehidratación y envolverlo con papel plástico y almacenar a – 80 ° C o proceder. 4. SDS electroforesis en gel de poliacrilamida Transferencia de la franja (hasta gel de lado) en una bandeja de 11 cm de equilibrio. Agregar 4 ml de tampón de reducción (6 M urea, 2% SDS, 0,05 M de Tris / HCl pH 8,8, 20% de glicerol, 2% TDT) para el canal y equilibrar la tira durante 10 minutos con agitación suave. Eliminar el buffer de reducción, añadir 4 ml de tampón de alquilación (6 M urea, 2% SDS, 0,05 M de Tris / HCl pH 8,8, 20% de glicerol, un 2,5% yodoacetamida) y equilibrar la tira durante 10 minutos con agitación suave. Enjuague la tira IPG por inmersión del STRIp brevemente en 1 X tampón SDS funcionamiento (25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% SDS, pH 8,2). Coloque el lado del gel de la tira para arriba sobre la placa posterior de los 11 cm Criterio prefabricados 10,5% y un 14% Tris-HCl en gel de poliacrilamida SDS (Bio-Rad) y presione suavemente en el modo que se haga pleno contacto con el gel de SDS; asegurarse de que no haya burbujas atrapadas entre las dos superficies de gel. Superposición de la tira IPG con 1 ml de solución de agarosa fundida (0,5% de agarosa, 25 mM Tris, 192 mM glicina, SDS 0,1%, azul de bromofenol) y dejar solidificar la agarosa durante 5 minutos. Carga de 5 l de proteína marcadora 10-225 kDa (USB, P / N: 76740) en el único pozo como estándares de peso molecular. Ejecute el gel de SDS buffer (25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% SDS, pH 8.2) a 200 V a temperatura ambiente o en un cuarto frío (4 ° C), utilizando el azul de bromofenol migración frente tinte para controlar la electroforesis. Quitar el gel de la fundición de plástico y mancha la noche agitando suavemente en azul brillante de CoomassieR-250 mancha (45,5% de metanol, el 45,5% dH2O, el 9,0% de ácido acético, 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250). Agite el gel en una solución Destain (45,5% de metanol, el 45,5% dH 2 O, 9,0% de ácido acético) dos veces durante 3 horas cada uno y en Destain 2 (5% de metanol, 90% dH 2 O, 5% de ácido acético) durante la noche. Guarde el gel en el 7% de ácido acético para el análisis. 5. Gel de imágenes y análisis Capturar imágenes de los geles utilizando la cantidad Un programa de software que opera el sistema de imágenes VersaDoc (BioRad). Cultivos las áreas de imagen de manera uniforme para todos los geles en su experimento. Cargar las imágenes recortadas en el programa PDQuest software 8.0 para crear un conjunto de experimentos. Siga el asistente de configuración experimento para definir los parámetros para la detección de puntos y el punto correspondiente a través de los geles. Revisar y perfeccionar el lugar correspondiente los resultados manualmente si es necesario. Realizar un análisis cuantitativo y estadístico de los geles para detectar manchas de proteínas emparejado con twdiferencias estadísticamente significativas o veces o más en la expresión entre los dos grupos de gel. Crear un análisis conjunto de estos puntos de interés y recortarlas utilizando un cortador lugar EXQuest (BioRad) para la digestión de la tripsina y la LC-MS-basado en la identificación de proteínas. 6. En-gel tríptico digestión Para este paso un Pierce modificado en gel tríptico Compendio Kit (# 89871X, Pierce) se utiliza el protocolo. Añadir 200 l de solución decolorante (25 mM de bicarbonato de amonio, el 50% de acetonitrilo) a los enchufes de gel. Agitar e incubar las muestras a 37 ° C durante 30 minutos con agitación. Retire con cuidado y deseche la solución. Repita el paso 6.1. Añadir 30 l de tampón recién preparado la reducción (50 mM Tris [2-carboxietil] fosfina, un 22,5 mM de bicarbonato de amonio) a los tubos con los tapones de gel e incubar a 60 ° C durante 10 minutos. Permita que las muestras que se enfríe, luego retirar y desechar el buffer de la reducción. Añadir 30 l de tampón de alquilación (100 mM yodoacetamida, 20 mM de bicarbonato de amonio, preparada inmediatamente antes de su uso en tubos envueltos en papel de aluminio. Incubar las muestras en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hora. Retire y deseche el buffer de alquilación. Lave los tapones de gel mediante la adición de 200 l de solución de decoloración de cada tubo. Incubar las muestras a 37 ° C durante 15 minutos. Retire y deseche la solución decolorante y repetir el lavado. Añadir 50 l de acetonitrilo a los tapones de gel e incubar por 10 minutos a temperatura ambiente para permitir que se contraigan en seco, a continuación, retire con cuidado el acetonitrilo. Repita el paso 6.8, una vez más. Piezas de gel debe verse blanca y pequeña. Permiten que las piezas de gel se seque en un concentrador de CentriVap (Labconco, modelo EX1245) durante 10 minutos. Engrosar las piezas de gel mediante la adición de 10 l de solución de tripsina activada (10 tripsina ng / l, 25 mM de bicarbonato de amonio). Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Añadir 25 l tampón de digestión (25 mM de bicarbonato de amonio) a los tubos. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante la noche con agitación. Sonicar las muestras durante 10 minutos (Branson, modelo baño sonicador 2510) y el giro hacia abajo antes de retirar el sobrenadante a un tubo nuevo. Guardar el sobrenadante. A fin de extraer los péptidos, se añaden 10 l de 0,1% de ácido fórmico y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente con agitación. Sonicar las muestras durante 10 minutos, recoge el sobrenadante y se combinan con sobrenadante guardado en el paso 6.13. 7. Desalación microescala de los extractos peptídicos Eliminar el bicarbonato de amonio y otras sales en los extractos peptídicos con la ayuda de PepClean C-18 columnas de centrifugado (ThermoFisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Péptidos eluir dos veces con 20 l de acetonitrilo 70%, se evaporan las muestras secas por centrifugación en el Concentrador CentriVap durante 1 hora y resuspenderlos péptidos en 10 l de ácido fórmico al 0,1% para el análisis de MS. 8. La identificación de proteínas por HPLC-espectrometría de masas acoplada Independiente de 5 l de la mezcla de péptidos en un cromatógrafo de líquidos de alta eficacia (HPLC) de más de 40 minutos, utilizando un gradiente lineal de 20 a 50% de acetonitrilo con 0,2% de ácido fórmico en una Pepswift monolítica PS-DVB columna (Dionex) acoplado a un nanospray I de origen en un espectrómetro de trampa de iones de masas (LCQ Deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) con un caudal de 400 nL / min en la punta. Detectar péptido MS1 señales entre 400 a 1400 m / z y permiten los 3 picos de iones más intensos que ser aislado para MS2 secuenciación por CID con la exclusión dinámica. Para la identificación de proteínas, análisis de los resultados de péptidos a través de una búsqueda de base de datos de referencia del ratón Sequest (BioWorks software Thermo-Fisher Scientific) con una modificación de la cisteína estática alquiladas y modificaciones dinámicas de la fosforilación (serina, treonina, tirosina), metilaciónción (histidina), oxidación (metionina), ADP-ribosilación (arginina), y la acetilación N-terminal. Aplicar criterios de coincidencia conservadora (por ejemplo, la tolerancia péptido establece en 2 UMA y 1,00 tolerancia fragmento, proteínas contienen al menos dos péptidos pasar un Xcorr vs Estado de carga del filtro [z = 1 / x = 1.5, z = 2 / x = 2.00, z = 3 / x = 2.50, z = 4 / x = 3,00] y una probabilidad de p <0,05) y cinco inspeccionar manualmente los espectros de MS para la identificación de proteínas confianza. 9. Los resultados representativos: Hombres y mujeres no ejercidas, el músculo esquelético murino (bíceps braquial) se extrae y se separa en un mapa en dos dimensiones 5, el primer nivel del músculo comparativo del proteoma (Figura 2). Una vez visualizado el uso de alta resolución de imágenes digitales, cerca de 800 puntos de la proteína fueron detectados en cada uno. Utilizando el mapa del proteoma masculina como una línea de base, está claro que hay numerosos lugares que el cambio en la abundancia en el proteoma de las mujeres. La intensidad de mancha se medidas del cambio en las cantidades de proteínas (Figura 3). Las identidades de las manchas de proteínas que cambian más de dos veces (hacia arriba o hacia abajo) y son estadísticamente significativas (p <0,05) con un n = 5 ratones, se determinó mediante análisis de la secuencia de aminoácidos utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas acoplada. Estos resultados muestran que las mujeres demuestran una disminución de la abundancia de las enzimas de azúcar en el metabolismo energético y en la enzima creatina quinasa (CK) isoformas, un sistema de suministro de energía diferentes en los músculos. Los seres humanos y animales muestran mayores niveles séricos de CK macho en reposo y después del ejercicio 9,10, pero los niveles séricos de CK no se corresponden necesariamente con la cantidad de interrupciones miofibrilar 11,12. Este dimorfismo de género en la abundancia celular de CK en el músculo bíceps braquial murino es una novela finding5 y puede responder a las fisiológicamente diferentes niveles séricos de CK. Cifras: g1.jpg "/> Figura 1. Un esquema general del protocolo para la proteómica comparativa. El protocolo se divide en tres grupos: preparación de muestras, análisis de la muestra, y, la identificación de proteínas. Los extremos de cada uno de estos tres grupos de protocolos también están haciendo una pausa razonable lugares, aunque los mejores resultados se obtuvo, si el protocolo general se lleva a cabo sin parar. Figura 2. Comparación de las mujeres proteína murina bíceps braquial puntos en relación con los puntos idénticos en bíceps braquial masculino (verde o círculos). Puntos que el aumento mayor o igual a dos veces en las mujeres con un círculo rojo (o) y los que bajaron menos que o igual a dos veces con un círculo azul (o). Figura 3 Punto Gel Análisis de Intensidad:. Del eje X, las mujeresantes del ejercicio (control, n = 5), eje Y, las mujeres solteras que pelea 0 grupo de puntos de horas de tiempo (n = 5). Línea de regresión: coeficiente de correlación = 0,919; pendiente = 0,976; interceptar = -0.0293. Puntos por encima de la línea roja y por debajo de la línea azul cambiar más de + / – dos veces.