インドのインクインフレーション:腫瘍結節を可視化する染色法

1. インドのインキインフレーションを用いた肺転移の検証

注: ルシファーゼ生きた腫瘍イメージング結果を検証するには、腫瘍を持つマウス肺のインドのインクインフレを行い、腫瘍結節を定量化する。4T1細胞は他の臓器や組織にも転移し(図1)、したがって、腫瘍転移を検証するためにこれらの器官の組織学的検査を必要に応じて行うべきである。このプロトコルは、例として肺転移を使用します。

1. 安楽死のために既存のホームケージにマウスを保管してください。他の動物と一緒に収容された場合は、別のケージに安楽死させられていないマウスを再配置する。
2. ケージフィルターの上部を取り外し、CO2フィルター上部に交換します。圧縮 CO2 ガスボンベ (100%)CO2 フィルタの上部に接続されています。流量を2 L/minに設定し、CO2を10分以上オンにします。マウスが10分の終わりにまだ呼吸している場合は、マウスが呼吸を止めてから少なくとも1分までCO2をオンにします。CO2シリンダ制御と流量計をオフにします。さらに3分間待ってから、フィルターの上を外します。
3. 犠牲マウスを背中に付け、ポリスチレンボードに置きます。脚を固定して、気管へのアクセスを妨げないようにします。70%エタノールでマウスをスプレーします。
4. はさみを使用して、胸部を通してマウスの中腹部の正中線に沿って、唾液腺に向かって切る。気管を観察します。気管を取り囲む組織を取り除くために鉗子を使用して気管を露出させる。
5. 気管の下にピペットチップを通します。片手で先端を持ち、気管をそっと上げ、体から離します。
6. マウスを180°も押したままのプラットフォームを回転させます。1/2 CC 27 G 1/2 結核シリンを使用して、インドインク(インドインク10%、水酸化アンモニウム0.1%)を気管を介して肺に注入します。強い抵抗が感じられるまでインクで肺を完全に膨らまします。
7. はさみを使って気管を切ります。鉗子を使用してマウスを保持し、肺の下に別の鉗子を挿入し、マウスから肺葉を引き出します。水を含むビーカーで肺を短時間すすぐるみます。
8. 化学煙フードで、3 mlのFekete溶液(50%エタノール、6%ホルムアルデヒド、3%氷酢酸)を含むガラスシンチレーションバイアルに肺を移す。バイアルをキャップして溶液が蒸発するのを防ぎます。
   注: 組織は、フェケテの溶液中に無期限に保存することができます。
9. 数分後、黒い肺に白い点として腫瘍結節を観察する(図1)。白い腫瘍結節は目で見える。煙のフードで皿に肺を転送し、白い斑点の数を数えます。各白色スポットは、単一の転移性腫瘍結節を表す。

図 1.インドインクインフレーションによる肺腫瘍結節の可視化腫瘍を持つマウスの肺をインドのインクで膨らませ、Feketeの溶液に固定した。白い点は肺転移である。