Indien Ink Inflation: En farvning metode til at visualisere Tumor Knuder

1. Validering af lungemetastaser Ved hjælp af Indien Ink Inflation af tumorbærende lunger

BEMÆRK: For at validere luciferase levende tumor imaging resultater, udføre Indien blæk inflation af tumor-bærende mus lunger til at kvantificere tumor knuder. 4T1 celler også metastasere til andre organer og væv (Figur 1), og derfor bør histologiske undersøgelse af disse organer for at validere tumormetastase udføres, hvis det er nødvendigt. Denne protokol bruger lungemetastase som eksempel.

1. Hold mus i deres eksisterende hjemmebur til aktiv dødshjælp. Når de er opstaldet med andre dyr, skal du flytte disse mus, der ikke aflives til et andet bur.
2. Fjern burfilterets top og udskift med CO2-filterpladen. Tænd for den komprimerede CO2-gasflaske (100 %) der er forbundet til CO2-filterpladen. Indstil strømningshastigheden til 2 L/min og hold CO2 tændt i mindst 10 min. Hvis musene stadig trækker vejret i slutningen af 10 minutter, skal du lade CO2 være tændt indtil mindst 1 minut efter, at musene holder op med at trække vejret. Sluk for CO2-cylinderstyringen og flowmåleren. Vent i 3 minutter mere, og fjern filterpladen.
3. Placer den ofrede mus på ryggen på et polystyrenbræt. Fastgør benene for at sikre uhindret adgang til luftrøret. Spray musene med 70% ethanol.
4. Brug en saks, skåret langs midterlinjen af midten af maven af musen gennem brystkassen og op mod spytkirtlerne. Overhold luftrøret. Brug pincet til at fjerne væv omkring luftrøret for at eksponere luftrøret.
5. Tråd en pipette spids under luftrøret. Hold spidsen med den ene hånd, løft forsigtigt luftrøret op og væk fra kroppen.
6. Drej platformen med musen 180°. Brug en 1/2 CC 27 G 1/2 tuberkulin sprøjte til at injicere Indien Ink (10% Indien blæk og 0,1% Ammonium Hydroxid) i lungerne via luftrøret. Pump lungerne helt op med blæk, indtil der mærkes en stærk modstand.
7. Brug en saks til at skære luftrøret. Brug pincet til at holde musen og indsætte et andet sæt pincet under lungerne og trække lungeflipperne ud af musen. Skyl lungerne kort i et bægerglas indeholdende vand.
8. I en kemisk røghætte overføres lungerne til et glasscintillationsglas, der indeholder 3 ml Feketes opløsning (50% ethanol, 6% formaldehyd og 3% iseddike). Hætteglasset for at forhindre opløsningen i at fordampe.
   BEMÆRK: Vævene kan opbevares i Fekete's opløsning på ubestemt tid.
9. Efter et par minutter skal du observere tumor knuder som hvide prikker på de sorte lunger(Figur 1). Den hvide tumor knude er synlig af øjnene. Overfør lungerne til en skål i en røghætte og tælle antallet af hvide pletter. Hver hvid plet repræsenterer en enkelt metastatisk tumor knude.

Figur 1. Visualisering af lungetumor knuder af Indien Ink Inflation. Lungen af tumorbærende mus blev oppustet med Indien blæk og fast i Fekete's løsning. De hvide prikker er lungemetastaser.