Hindistan Mürekkep Enflasyonu: Tümör Nodüllerini Görselleştirmek İçin Bir Boyama Yöntemi

1. Tümör Taşıyan Akciğerlerin Hindistan Mürekkep Enflasyonu Kullanılarak Akciğer Metastazlarının Doğrulanması

NOT: Luciferaz canlı tümör görüntüleme sonuçlarını doğrulamak için, tümör nodüllerini ölçmek için tümör taşıyan fare akciğerlerinin Hindistan mürekkep şişirmesini gerçekleştirin. 4T1 hücreleri de diğer organ ve dokulara metastaz yapmakta (Şekil 1) ve bu nedenle gerektiğinde tümör metastazını doğrulamak için bu organların histolojik incelemesi yapılmalıdır. Bu protokol örnek olarak akciğer metastazı kullanır.

1. Fareleri ötanazi için mevcut ev kafeslerinde tutun. Diğer hayvanlarla barındırıldığında, ötenazi olmayan fareleri farklı bir kafese yerleştirin.
2. Kafes filtresi üstünü çıkarın ve CO2 filtre üst ile değiştirin. Sıkıştırılmış CO2 gaz silindirini açın (%100) CO2 filtre üst kısmında bağlı olan. Akış hızını 2 L/dk olarak ayarlayın ve CO2'yi en az 10 dakika açık tutun. Fareler hala 10 dakikanın sonunda nefes alıyorsa, fareler nefes almayı bıraktıktan en az 1 dakika sonrasına kadar CO2'yi açık bırakın. CO2 silindir kontrolünü ve akış ölçeri kapatın. 3 dakika daha bekleyin ve filtre üst kısmından çıkarın.
3. Kurban edilen fareyi sırtına bir polistiren tahtasına yerleştirin. Nefes borusuna engelsiz erişim sağlamak için bacakları sabitle. Farelere% 70 etanol püskürtün.
4. Bir makas kullanarak, farenin orta karnının orta çizgisi boyunca göğüs kafesi boyunca ve tükürük bezine doğru kesin. Nefes borusuna dikkat edin. Trakeayı çevreleyen dokuları çıkarmak için nefes borusu kullanın.
5. Nefes borusunun altına pipet ucu geçirin. Ucu bir elinizle tutarak, nefes nefesini yavaşça yukarı ve vücuttan uzağa kaldırın.
6. Fareyi tutan platformu 180° döndürün. Hindistan Mürekkebini (%10 Hindistan mürekkedi ve %0,1 Amonyum Hidroksit) nefes borusundan akciğerlere enjekte etmek için 1/2 CC 27 G 1/2 tüberkülin şırınna kullanın. Güçlü bir direnç hissedilene kadar akciğerleri mürekkeple tamamen şişirin.
7. Nefes nefesini kesmek için bir makas kullanın. Fareyi tutmak ve akciğerlerin altına başka bir küme uzunlagı doğrmak ve akciğer loblarını fareden çıkarmak için asaları kullanın. Akciğerleri su içeren bir beherde kısa bir süre durulayın.
8. Kimyasal duman kaputunda, akciğerleri 3 ml Fekete çözeltisi (%50 Etanol, %6 Formaldehit ve%3 buzul asetik asit) içeren cam bir scintillation şişesine aktarın. Çözeltinin buharlaşmasını önlemek için şişeyi kapleyin.
   NOT: Dokular Fekete'nin çözeltisinde süresiz olarak saklanabilir.
9. Birkaç dakika sonra, tümör nodüllerini siyah akciğerlerde beyaz noktalar olarak gözlemleyin (Şekil 1). Beyaz tümör nodülü gözlerle görülebilir. Akciğerleri duman kapüşonlu bir tabağa aktarın ve beyaz lekelerin sayısını sayın. Her beyaz nokta tek bir metastatik tümör nodüllerini temsil eder.

Şekil 1. Akciğer Tümörü Nodüllerinin Hindistan Mürekkep Enflasyonu ile Görselleştirilmesi. Tümör taşıyan farenin akciğeri Hindistan mürekkedi ile şişirildi ve Fekete'nin çözeltisinde sabitlendi. Beyaz noktalar akciğer metastazlarıdır.