Co-dyrkning BC Celler: Culturing breast cancer celler med knoglefragmenter til at studere kræft cellespredning

1. Co-dyrkning af brystkræftceller støder op til knoglefragmenter til måling af spredning af brystceller ved hjælp af BLI

1. Forud for forsøget skal du forberede en suspension, der indeholder 2 x^{10 5} brystkræftceller/50 μl, og forberede stik af knoglevoks til immobilisering af knoglefragmenter i kulturen. Skær en P200 micropipette spids i 3 stykker og bruge den smalle ende af det største stykke i en "cookie cutter" måde at skære små (~ 35 mg) stykker knoglevoks. Brug den brede ende af det mindste stykke til at skubbe knoglevokspropperne ud i en petriskål til opbevaring.
2. Placer et stykke knoglevoks på 12 klokken position af hver brønd og forsigtigt trykke ned med en steril-behandsket pegefinger.
3. Pipette 50 μl celleaffjedring indeholdende 1 x^{10 5} brystkræftceller i DMEM-10% FBS + Pen-Strep i midten af hver brønd af en 6-brønds plade. (Alternativt kan du finde celler i et spredt mønster, hvis det ønskes). Pladen anbringes i en 37 °C vævskulturinkubator i 45 minutter for at fremme celletilbehør.
4. Placer 1 knoglefragment på 1 stykke knoglevoks for hver eksperimentel brønd og påfør blidt tryk med rongeuren for at sikre den. Udfør forsøg med tre eksemplarer, således at 3 knoglefragmenter fra en given THR-prøve placeres i de tre øverste brønde, mens de nederste tre brønde kun indeholder knoglevoks som kontrol.
5. Ved hjælp af en 5 ml pipette, forsigtigt og langsomt levere 5 ml DMEM-10% FBS til siden af hver brønd for at undgå at løsne brystceller eller knoglefragmenter. Pladen anbringes i en 37 °C vævskulturinkubator i 20-24 timer.
6. For at udføre bioluminescensbilleddannelse (BLI) fjernes pladen fra inkubatoren og tilsættes luciferinunderlag (for at opnå en koncentration på 300 μg/ml) til hver brønd. Billede pladen straks på en IVIS Imaging Platform ved hjælp af følgende parametre: f-stop på 1, lille binning, eksponeringstid på 1 sek, niveau D. Mål signalintensiteten af hver samt gennemsnitlig udstråling (fotoner / anden / kvadratcentimeter / steradian).
7. Brug billedbehandlingssoftware til at definere ROI (Regions of Interest) for at kvantificere den gennemsnitlige udstråling for alle forsøgs- og kontrolbrønde. Eksportere gennemsnitlige udstrålingsværdier til et Excel-ark for at udføre statistik og generere grafer.